【摘要】：水皰性口炎(Vesicular stomatitis)是由水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)感染引起牛、馬、豬等多種動(dòng)物和人的一種人獸共患傳染病。盡管目前我國(guó)還沒(méi)有VSV感染病例的報(bào)道,但國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)云南省蝙蝠攜帶病毒的病原生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),蝙蝠是VSV的攜帶者,提示該病的發(fā)生具有潛在風(fēng)險(xiǎn)。最近幾年來(lái),羊小反芻獸疫和非洲豬瘟這兩個(gè)外來(lái)病陸續(xù)傳入我國(guó),給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,水皰性口炎作為危害性較大的外來(lái)病也應(yīng)該引起大家的高度關(guān)注!因此,積極開(kāi)展VSV相關(guān)的基礎(chǔ)研究工作對(duì)于該病的防控具有重要的科學(xué)意義。同時(shí),VSV具有廣泛的細(xì)胞嗜性,使其成為用于病毒與宿主間相互作用、病毒疫苗載體等多方面研究的一個(gè)較為理想的模式病毒,并且在相關(guān)領(lǐng)域取得了較多的研究進(jìn)展。盡管VSV作為病毒載體已得到了廣泛的研究和應(yīng)用,但作為一種活病毒載體,很多研究人員認(rèn)為其具有潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn),尤其VSV對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的侵嗜性成為臨床上VSV載體應(yīng)用的最大障礙。此外,前期工作中,利用酵母雙雜交技術(shù)、GST-pull down以及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)等證實(shí)VSV基質(zhì)蛋白(M)能與宿主細(xì)胞翻譯起始因子eIF3i相互作用,但VSV在神經(jīng)細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中,eIF3i發(fā)揮怎樣的調(diào)控作用并不清楚。首先,細(xì)胞凋亡與病毒的復(fù)制增殖密切相關(guān),本研究通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),VSV感染鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(Neuro-2a,N2a)12 h或24 h后,感染細(xì)胞細(xì)胞核碎裂,染色質(zhì)致密濃染,并增強(qiáng)藍(lán)色熒光。同時(shí),利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)VSV感染N2a細(xì)胞過(guò)程中細(xì)胞凋亡的情況,結(jié)果顯示,VSV感染N2a細(xì)胞8 h后,與對(duì)照組相比,VSV感染細(xì)胞凋亡率顯著升高,表明VSV可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。而利用Western blotting檢測(cè)VSV感染N2a細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn),Akt蛋白激酶活化及其下游關(guān)鍵促凋亡蛋白Bax表達(dá)情況,結(jié)果顯示,VSV可以抑制Akt磷酸化(p-Akt)并且促進(jìn)Bax表達(dá),表明VSV可經(jīng)Akt/Bax信號(hào)通路誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡。其次,為了明確VSV感染對(duì)eIF3i表達(dá)的影響,本研究利用qRT-PCR和Western blotting方法,分別從基因和蛋白水平研究eIF3i在VSV感染神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá);結(jié)果發(fā)現(xiàn),VSV(MOI=10)感染N2a細(xì)胞4 h或8 h后,VSV促進(jìn)eIF3i蛋白表達(dá),但是在VSV感染12 h后,VSV抑制eIF3i蛋白表達(dá);表明VSV感染神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中,早期VSV感染促進(jìn)eIF3i的表達(dá),而后期VSV感染抑制eIF3i的表達(dá)。再者,本研究設(shè)計(jì)、合成針對(duì)eIF3i的siRNA或構(gòu)建eIF3i過(guò)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞后接種VSV,通過(guò)Western blotting、熒光定量PCR、以及TCID_(50)等方法檢測(cè)病毒的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾eIF3i的表達(dá)促進(jìn)VSV的復(fù)制,而過(guò)表達(dá)eIF3i抑制VSV的復(fù)制。為進(jìn)一步研究神經(jīng)細(xì)胞eIF3i對(duì)VSV復(fù)制的作用機(jī)制,本研究利用Western blotting檢測(cè)VSV感染N2a細(xì)胞后Akt的激活情況,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)eIF3i可以促進(jìn)p-Akt表達(dá)上調(diào),而干擾eIF3i顯著抑制p-Akt的表達(dá)。其次,利用Akt特異性激活劑SC79激活N2a細(xì)胞Akt信號(hào)通路,再接種病毒,發(fā)現(xiàn)Akt被激活后,VSV復(fù)制顯著受到抑制。上述結(jié)果證明神經(jīng)細(xì)胞eIF3i的表達(dá)與Akt的激活密切相關(guān),并且eIF3i可促進(jìn)Akt的磷酸化,調(diào)控細(xì)胞凋亡抑制VSV的復(fù)制。再者,VSV感染干擾或過(guò)表達(dá)eIF3i的神經(jīng)細(xì)胞后,qRT-PCR檢測(cè)Irf3、Irf7、IFNβ基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)干擾eIF3i后,干擾素相關(guān)基因表達(dá)水平顯著下調(diào);而過(guò)表達(dá)eIF3i后,干擾素相關(guān)基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。上述結(jié)果表明,神經(jīng)細(xì)胞eIF3i可通過(guò)促進(jìn)Akt的激活,調(diào)控細(xì)胞凋亡干擾病毒粒子的釋放,以及eIF3i可同時(shí)促進(jìn)干擾素相關(guān)基因的表達(dá),啟動(dòng)抗病毒反應(yīng)來(lái)抑制VSV復(fù)制增殖。綜上所述,VSV感染神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)與eIF3i相互作用并影響其表達(dá),經(jīng)Akt途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡并影響抗病毒反應(yīng)來(lái)調(diào)控VSV的復(fù)制增殖。該研究成果不僅揭示神經(jīng)細(xì)胞eIF3i在VSV復(fù)制過(guò)程中的作用,而且可能為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抗VSV的防治研究提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

圖 1.1 Hoechst 33258 染色觀察 (標(biāo)尺：400 μM)Figure 1.1 The Observation of N2a cell staining Hoechst 33258（Scale bars：400 μM）A:正常組 B:VSV 感染 12 h C: VSV 感染 24 hA: The normal group B: N2a cell infected VSV after 12 h C: N2a cell infected VSV after 24 h1.3.2 VSV 感染神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)應(yīng)用 Annexin-V FITC/PI 雙標(biāo)試劑盒對(duì) VSV 感染的 N2a 細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)間段 VSV 感染 N2a 細(xì)胞的凋亡率，如圖所示，在雙變量散點(diǎn)圖上，Q1 表示死細(xì)胞，Q2 表示中晚期凋亡細(xì)胞，Q3 表示活細(xì)胞，Q4 表示早期凋亡細(xì)胞， Q2 和 Q4 細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比代表細(xì)胞的凋亡率（圖1.2A）。結(jié)果表明，VSV 感染 N2a 8 h，12 h 后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率顯著上升（圖 1.2B），證明 VSV 可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞 N2a 發(fā)生凋亡。

圖 1.2 VSV 感染神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)ure 1.2 The detection of apoptosis rate of N2a cells infected with VSV散點(diǎn)圖分析柱狀圖variate scatter plot B：Histogram of apoptosis rate analysisSV 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞 Akt 激酶的影響及其相關(guān)信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本研究利用 Western blotti酶磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 Prism 軟件中的獨(dú)立樣本 T 檢驗(yàn)進(jìn)行作成柱狀圖。結(jié)果表明 VSV 感染 N2a 后 2 h、4 h、6 h、8 h 后 顯著下調(diào)（圖 1.3A,B），表明 VSV 感染抑制 Akt 激酶活性，進(jìn)而關(guān)通路。

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本文編號(hào)：2718192