【摘要】：豬回腸炎(全稱豬增生性回腸炎porcine proliferative enteropathy,PPE)是由胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia intracellularis,LI)引起的一種以回腸及盲腸結(jié)處近端的結(jié)腸、盲腸黏膜呈腺瘤增生為主要特征的腸道疾病。胞內(nèi)勞森菌主要損害豬的腸道,嚴(yán)重影響豬的料肉比。胞內(nèi)勞森菌基因組達(dá)170多萬個堿基對,有1324個蛋白編碼區(qū),盡管有些蛋白如LsaA蛋白、LatA蛋白和LhlyA蛋白被報道,還有許多蛋白未被研究,LS1087蛋白是胞內(nèi)勞森菌的假定膜蛋白,LS1136蛋白是胞內(nèi)勞森菌的假想蛋白,本研究從回腸炎陽性病料提取DNA,通過PCR、質(zhì)粒構(gòu)建和原核表達(dá)得到了LS1087和LS1136蛋白,通過雜交瘤技術(shù)制備了針對兩種蛋白的單抗,為胞內(nèi)勞森菌的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。1.LS1087蛋白和LS1136蛋白原核表達(dá)根據(jù)GenBank中胞內(nèi)勞森菌全基因序列(AM180252.1)設(shè)計引物,從回腸炎陽性病料中提取DNA,通過PCR獲得LS1087基因片段和LS1136基因片段。將LS1087基因片段和LS1136基因片段克隆至原核質(zhì)粒pET-32a和pGEX-4T-1,獲得重組質(zhì)粒pET-32a-LS1087、pGEX-4T-1-LS1087、pET-32a-LS1136和pGEX-4T-1-LS1136。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株,并表達(dá)了融合蛋白LS1087-His、LS1087-Gst、LS1136-His和LS1136-Gst,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示:融合蛋白主要以包涵體形式存在,融合蛋白LS1087-His、LS1087-Gst、LS1136-His、和LS1136-Gst大小分別為38 kDa、44 kDa、55 kDa和64 kDa。使用鎳柱純化LS1087-His和LS1136-His蛋白,使用DTT、DOC(脫氧膽酸鈉)和SKL等試劑純化LS1087-Gst和LS1136-Gst蛋白,結(jié)果LS1087-His和LS1136-His蛋白比LS1087-Gst和LS1136-Gst蛋白純化效果好。2.抗LS1087蛋白和LS1136蛋白單克隆抗體的制備將LS1087-Gst和LS1136-Gst蛋白混合作為免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,將LS1087-His和LS1136-His蛋白混合作為檢測抗原,經(jīng)ELISA方陣滴定和間接ELISA確定抗體水平最高的小鼠,采用雜交瘤技術(shù),成功篩選到5株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為7E9、9D8、15H10、16A1和16G10。ELISA實(shí)驗和Western blotting實(shí)驗結(jié)果顯示:7E9和9D8抗LS1087蛋白,15H10、16A1和16G10抗LS1136蛋白。單抗特異性試驗結(jié)果顯示:5株單抗與其他9種細(xì)菌超裂液未出現(xiàn)明顯的交叉反應(yīng)。免疫組化試驗表明:5株單抗均能特異性結(jié)合胞內(nèi)勞森菌。目前,國內(nèi)未見制備抗胞內(nèi)勞森菌蛋白單克隆抗體的報道,本研究制備抗胞內(nèi)勞森菌蛋白單克隆抗體,并成功獲得了5株能特異性結(jié)合胞內(nèi)勞森菌的單抗,這5株單抗可作為勞森菌分離或檢測的工具,為今后進(jìn)一步的研究打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61
【圖文】：

與 LS1087 基因預(yù)期大小相符（圖 2.1）。.1.2 重組克隆菌的菌落 PCR 鑒定pET-32a-LS1087 重組菌 PCR 結(jié)果顯示，隨機(jī)挑約 615 bp 左右的單一條帶（圖 2.2）。M：DNA 1：LS1082：陰性對M:DNA M1:The ampLS1087 fra2:Negativ圖 2.1 LS1087 基因 PCR 擴(kuò)Fig 2.1 The PCR amplified produc

.3.1.3 重組表達(dá)菌的菌落 PCR 鑒定pET-32a-LS1087 重組表達(dá)菌 PCR 結(jié)果顯示，大小約 615 bp 左右的明顯條帶（圖 2.4）。圖 2.3 PCR 鑒定 pGEX-4Fig2-3 Colony PCR analysis of the Trans5α

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本文編號：2715380