【摘要】：奶業(yè)已成為中國畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。隨著奶牛產(chǎn)奶量的不斷提高,以及部分奶牛場及農(nóng)戶對奶牛的飼養(yǎng)管理不科學(xué),奶牛代謝疾病也隨之增多。奶牛酮病是由產(chǎn)后能量供需不平衡,引起脂肪和碳水化合物代謝紊亂,導(dǎo)致的一種全身功能失調(diào)性疾病�？芍庐a(chǎn)奶量減少、奶質(zhì)變差并影響后代素質(zhì),奶牛淘汰率升高等,給畜牧業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。為探討酮病奶牛圍產(chǎn)期能量代謝負(fù)平衡狀態(tài)對乳汁蛋白組學(xué)的影響,研究酮病奶牛能量代謝負(fù)平衡與乳汁蛋白組學(xué)變化特征之間的關(guān)系,并獲得酮病奶牛乳汁蛋白組學(xué)圖譜,尋找酮病奶牛乳蛋白中的早期監(jiān)測標(biāo)志物。本實驗通過非標(biāo)定量(Label-Free)蛋白組學(xué)方法,對酮病奶牛乳脂球膜蛋白和乳清蛋白分別進(jìn)行檢測,結(jié)合生物信息學(xué)分析,獲得了奶牛乳汁全蛋白圖譜,并分析了酮病對牛乳蛋白組成的影響。隨后,選擇了炎癥相關(guān)乳脂球膜蛋白進(jìn)行ELISA驗證。在黑龍江省中部地區(qū)某千頭奶牛存欄量的集約化牧場,選取60頭產(chǎn)前14-21天奶牛收集血液,分娩后每3天于清晨榨乳前收集血液和乳汁一次,跟蹤采集至產(chǎn)后第28天。分離乳脂和脫脂乳分別凍存。對血液丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT),天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST),AST/ALT,堿性磷酸酶(ALP),總蛋白質(zhì)(TP),葡萄糖(GLU),甘油三酯(TG),游離脂肪酸(NEFA)和β羥丁酸(BHBA)進(jìn)行檢測,并將血清BHBA濃度≥1.40 mol/L奶牛分為酮病組,血清BHBA1.40 mol/L奶牛分為對照組,使用酮粉法進(jìn)行確認(rèn)。將酮病組和對照組奶牛的乳脂和脫脂乳分別混勻后,分別提取乳脂球膜蛋白和乳清蛋白樣品進(jìn)行蛋白定量、SDS-PAGE電泳和膠內(nèi)酶切,進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)蛋白組學(xué)檢測,并進(jìn)行三次技術(shù)重復(fù)。搜庫后,篩選差異蛋白,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。確定了酮病對奶牛乳汁蛋白組學(xué)的影響。隨后,對炎癥相關(guān)乳脂球膜蛋白進(jìn)行ELISA檢測。同樣根據(jù)血清BHBA濃度將奶牛分組。圍產(chǎn)期內(nèi)經(jīng)歷過酮病,血清BHBA水平≥1.40 mol/L的奶牛為酮病組,將圍產(chǎn)期無酮病發(fā)病史,BHBA1.40 mol/L且沒有酮病臨床癥狀的奶牛為對照組,并使用酮粉法進(jìn)行確認(rèn)。在酮病組奶牛分娩后的第7-14天,收集酮癥發(fā)作前的樣品為K1組,酮癥組奶牛第14-28天的樣品為K2。當(dāng)酮病組奶牛產(chǎn)后超過28天,血液BHBA水平1.40mol/L,收集的樣品為K3組,作為酮病恢復(fù)后的樣品。分娩后7-14天的對照組樣品為C1組。在14-28天收集的對照組樣品為C2組。分析獲得了正常和酮病奶牛產(chǎn)后炎癥相關(guān)乳脂球膜蛋白變化的規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示,酮病組的乳脂球膜蛋白組分有402個蛋白上調(diào)和308個蛋白下調(diào);乳清蛋白組分有22個蛋白上調(diào)和313個乳清蛋白下調(diào)。酮病導(dǎo)致了參與運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白轉(zhuǎn)運、囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運,發(fā)育成熟和免疫系統(tǒng)反應(yīng)等生物過程均受到了很大影響�？股氐纳锖铣�、核糖體、內(nèi)吞作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、癌癥通路通路改變顯著。對酮病奶牛炎癥相關(guān)乳脂球膜蛋白的檢測中發(fā)現(xiàn),C2中的c4b結(jié)合蛋白α鏈(C4BPA),凝血酶原(F2),補(bǔ)體3(C3)和α-1-酸性糖蛋白(ORM1)顯著高于K2組(p0.05),而單核細(xì)胞分化抗原(CD14)顯著降低(p0.05)。K2中的α-inter-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4(ITIH4),補(bǔ)體9(C9),F2,α-2-HS-糖蛋白(AHSG)和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白變體4(CD46)顯著高于K1(p0.05),而CD14和CD46顯著低于K1組(p0.05)。K3組中ITIH4,F2和ORM1顯著高于K1組(p0.05),CD14顯著低于K1組(p0.05)。K1組的ITIH4,C4BPA,C3和CD46顯著高于C1(p0.05),而F2,AHSG和ORM1顯著低于C1(p0.05)。K2中的CD14和ORM1顯著低于C2中(p0.05),K3組中血清淀粉樣蛋白A(SAA)和ORM1在顯著低于K2(p0.05)。且NEFA的濃度與BHBA、血液中C3、血液中C9、C3和ORM1水平顯著相關(guān)。BHBA的濃度與血液中C3,TNFα,血液中C9,CD14,C3,和ORM1水平顯著相關(guān),GLU濃度與TNFα和ITIH4水平顯著相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn),酮病時奶牛生產(chǎn)效率降低,能量負(fù)平衡導(dǎo)致肝功能受到損害。酮病導(dǎo)致奶牛能量代謝紊亂,乳腺分泌功能降低,乳汁免疫功能降低,部分闡明了能量負(fù)平衡導(dǎo)致乳汁蛋白變化的機(jī)制。證明奶牛酮病與圍產(chǎn)期炎癥相關(guān)代謝通路存在關(guān)系。酮病導(dǎo)致了牛奶中炎癥相關(guān)乳脂球膜蛋白變化,引發(fā)了圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎癥反應(yīng)。本實驗對于將來酮病的預(yù)測、預(yù)防和診斷,具有重要的意義和應(yīng)用價值。
【圖文】：

年的研究結(jié)果也支持關(guān)于炎癥介質(zhì)和代謝性疾病之間關(guān)系的推測。Ohtsuk生脂肪肝時，血液中炎性標(biāo)志物的濃度升高，而中度和重度脂肪肝奶牛血子(TNF)濃度也顯著升高[21]。奶牛圍產(chǎn)期發(fā)生炎癥反應(yīng)，將導(dǎo)致發(fā)生其他的風(fēng)險升高 8 倍，以及血鈣濃度下降，難以再次受孕，首月產(chǎn)奶量下降等[奶�？诜蓴_素（IFNα），發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥，并導(dǎo)致了急性期驗組奶牛與對照組奶牛相比，其產(chǎn)后兩周內(nèi)的血液酮體濃度顯著增高[23]。連續(xù)皮下注射 TNFα 七天，導(dǎo)致其肝臟甘油三脂含量升高了 1 倍[24]。因此質(zhì)代謝可以被炎癥反應(yīng)及炎性細(xì)胞因子干擾，這也可能是誘發(fā)奶牛酮病和謝性疾病的關(guān)鍵因素。量研究證實，圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡誘發(fā)了機(jī)體的免疫抑制。能量負(fù)平衡減緩能的恢復(fù)，泌乳初期的代謝應(yīng)激加劇了圍產(chǎn)期免疫抑制[25]。另外，奶牛在圖 1-1 圍產(chǎn)期奶牛免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)的主要關(guān)系e1-1 The main relationship of immune system，，endocrine system and metabolicperinatal cows

CD 36(或 PAS IV)，嗜乳脂蛋白 (Butyrophilin，BTN)和n，MFG—E8 或 PAS 6/7）。另外兩種都是分子量更小的非糖基化關(guān)蛋白 (Adipophilin，ADPH)和脂肪酸結(jié)合蛋白 (Fatty acid bindi的三層結(jié)構(gòu)理論已經(jīng)被人們普遍接受。從脂肪球內(nèi)核向外觀察，質(zhì)網(wǎng)合成的極性脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的單層膜，包裹著脂肪球內(nèi)核附著在雙層膜的內(nèi)表面的高密度蛋白層；最后才是真正來自乳腺細(xì)胞質(zhì)在高密度蛋白層和外部雙膜層之間形成細(xì)胞質(zhì)月牙[37]。Van乳脂球膜結(jié)合 2-DE 和 MALDI-TOF 技術(shù)，對乳脂球膜上的主要和鑒定，結(jié)合最新的研究進(jìn)展，建立了乳脂球膜蛋白的結(jié)構(gòu)模型（了以前 BTN、ADPH 和 XO/XDH 相連或相鄰的推測。構(gòu)建乳脂圖 1-2 乳脂球膜蛋白結(jié)構(gòu)模型Figure 1-2 The structure model of the milk fat pellet membrane
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2706065