發(fā)布時(shí)間：2020-06-10 03:20

【摘要】：嗜中性粒細(xì)胞抵抗入侵微生物途徑之一是通過嗜中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)介導(dǎo)完成的。NETs是新近發(fā)現(xiàn)的一種先天性免疫細(xì)胞胞外防御機(jī)制,存在于大多數(shù)免疫細(xì)胞中,如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。以自身DNA和組蛋白及多種殺滅病原的顆粒蛋白組成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),可以捕獲甚至殺滅細(xì)菌、真菌或病毒等。奶牛酮病是圍產(chǎn)期奶牛高發(fā)代謝性疾病,其特點(diǎn)就是高酮血癥。酮病增加了奶牛圍產(chǎn)期疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),尤其是脂肪肝、皺胃變位、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等基礎(chǔ)性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。一般認(rèn)為與酮病造成的先天免疫機(jī)能的抑制有關(guān)。近期研究表明,體外β-羥丁酸(BHBA)處理的中性粒細(xì)胞,可以使大腸桿菌誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)減少10倍,抑制抗菌活性。但酮病奶牛的高酮血癥對(duì)中性粒細(xì)胞NETs的產(chǎn)生又有何影響?BHBA是通過何種信號(hào)通路機(jī)制調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞NETs產(chǎn)生的,目前還不清楚。首先,研究酮病奶牛在高酮血癥條件下中性粒細(xì)胞NETs的狀態(tài)。激光共聚焦顯微鏡觀察表明,分離的酮病奶牛中性粒細(xì)胞可以向細(xì)胞外釋放纖維狀結(jié)構(gòu)(NETs)。同時(shí)針對(duì)NETs上的蛋白顆粒進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),通過激光共聚焦顯微鏡觀察到乙�；M蛋白、瓜氨酸組蛋白、髓過氧化物酶(MPO)等在NETs上表達(dá)。NETs游離DNA定量,表明酮病奶牛中性粒細(xì)胞釋放NETs的量均顯著高于正常奶牛。Western blotting結(jié)果顯示,中性粒細(xì)胞GPR109A-mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵分子表達(dá)增加。據(jù)此可以認(rèn)為,酮病奶牛在高酮血癥條件下中性粒細(xì)胞通過GPR109A-mTOR信號(hào)通路自發(fā)誘導(dǎo)NETs,致使細(xì)胞發(fā)生NETosis,可能引起自身免疫反應(yīng),而發(fā)生先天免疫抑制。其次,借助于激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡確定了體外添加BHBA可以誘導(dǎo)奶牛中性粒細(xì)胞NETs產(chǎn)生,且對(duì)BHBA具有一定的時(shí)間和濃度依賴性;BHBA增加中性粒細(xì)胞組蛋白乙�；凸习彼�,誘導(dǎo)奶牛中性粒細(xì)胞發(fā)生NETosis。免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)BHBA可以增強(qiáng)奶牛中性粒細(xì)胞內(nèi)自噬的積累,而自噬又可以調(diào)控NETs釋放。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確GPR109A-mTOR是否可以調(diào)節(jié)BHBA誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞NETs的釋放。同時(shí)添加GPR109A抑制劑百日咳毒素與BHBA處理中性粒細(xì)胞后,與BHBA單獨(dú)處理組相比較,混合處理組NETs釋放量顯著下降,其他蛋白顆粒酶活性顯著降低,伴隨自噬顯著降低,NETosis顯著減弱。利用流式細(xì)胞術(shù)證明BHBA可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS,而使用DPI與BHBA混合處理中性粒細(xì)胞后,與BHBA單獨(dú)處理組相比較,除ROS減少外,BHBA誘導(dǎo)奶牛中性粒細(xì)胞NETs釋放量也顯著下降,細(xì)胞內(nèi)自噬積累量顯著降低,抑制瓜氨酸組蛋白的表達(dá),抑制NETosis。此外,抑制ROS的產(chǎn)生可下調(diào)GPR109A表達(dá);當(dāng)自噬受到抑制時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著降低,這表明ROS同時(shí)參與BHBA誘導(dǎo)奶牛中性粒細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)和NETs的釋放。綜上這些結(jié)果證明BHBA可以通過GPR109A-mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)奶牛中性粒細(xì)胞NETs釋放,其中的關(guān)鍵點(diǎn)是自噬的潛在功能,而且此過程需要依賴于ROS的產(chǎn)生。最后,針對(duì)GPR109A-mTOR信號(hào)通路是否在外界病原性刺激時(shí)可以調(diào)節(jié)奶牛中性粒細(xì)胞NETs的釋放。體外添加BHBA及LPS作用于中性粒細(xì)胞,觀察GPR109A-mTOR關(guān)鍵分子的表達(dá)及NETs釋放。結(jié)果表明,LPS可以通過GPR109A-mTOR信號(hào)通路抑制BHBA誘導(dǎo)的NETs釋放,抑制NETosis;而BHBA同樣可以通過GPR109A-mTOR信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的NETs釋放,抑制NETosis。總之,BHBA可以通過GPR109A-mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)奶牛NETs產(chǎn)生,引起自身免疫反應(yīng),造成先天免疫抑制。BHBA可通過GPR109A-mTOR信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞NETs的釋放,降低機(jī)體對(duì)病原體的抵抗能力。研究結(jié)果為揭示酮病奶牛先天免疫抑制的機(jī)制和增強(qiáng)圍產(chǎn)期奶牛免疫機(jī)能提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

第二篇 研究?jī)?nèi)容 第一章 酮病奶牛中性粒細(xì)胞誘導(dǎo) NETs 產(chǎn)生性粒細(xì)胞 NETs 的產(chǎn)生，導(dǎo)致 NETosis，表明高酮血癥可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs。

圖 1.2 酮病奶牛中性粒細(xì)胞 NETs 上乙酰化組蛋白表達(dá)（1000×）Fig 1.2 Acetylation histone expression in neutrophils NETs in cows with ketosis（1000×）
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 周劍濤;丁海峰;夏瑾燕;;組蛋白瓜氨酸化介導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成[J];生命的化學(xué);2009年04期

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本文編號(hào)：2705696