【摘要】：2016年4月,四川雙流某黑斑蛙(Rana nigromaculata)養(yǎng)殖場(chǎng)的蝌蚪爆發(fā)一種流行性傳染病,死亡率近90%,主要臨床特征為腹部腫脹,下頜與腹部等體表出血;剖檢見(jiàn)腹腔內(nèi)有淡黃色腹水,肝腫大充血,腸道空虛,腔內(nèi)充有大量黏液,脾腫大。組織病理學(xué)上,患病蝌蚪心、肝、腎、腸與脾等全身多組織器官受損,出現(xiàn)明顯的變性與壞死病灶,且在肝細(xì)胞與腸上皮等細(xì)胞胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)嗜堿性包涵體�；疾◎蝌浇M織勻漿液接種鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(Epithelioma papulosum cyprini cell line,EPC),25℃恒溫培養(yǎng)4d,出現(xiàn)明顯的CPE,Reed-Muech法測(cè)得其滴度為10~7 TCID_(50)/0.1 mL。用5%濃度的病毒液浸泡8h對(duì)健康蝌蚪進(jìn)行人工感染試驗(yàn),感染蝌蚪表現(xiàn)出與自然發(fā)病蝌蚪相似的癥狀,死亡率達(dá)到80%,證實(shí)分離病毒為該病病原。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病毒顆粒為正六邊形、有囊膜,對(duì)角線直徑約135±8nm,在胞質(zhì)中呈晶格狀排列或游離狀;主要衣殼蛋白基因(Maior capsid protein,MCP)序列分析表明其與蛙病毒屬病毒的相似性在99%以上。綜上,判斷此次黑斑蛙蝌蚪大量死亡的病原為虹彩病毒科蛙病毒屬病毒,將其命名為黑斑蛙蛙病毒(Rana nigromaculata ranavirus,RNRV)。采用常規(guī)研究方法,對(duì)RNRV的病毒滴度、酸堿敏感性、胰蛋白酶敏感性、有機(jī)試劑敏感性、溫度敏感性以及病毒最適培養(yǎng)細(xì)胞系、最適培養(yǎng)溫度、增殖特性等理化特性與表型進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示RNRV具有與蛙病毒屬病毒相似的理化特性與表型,其對(duì)過(guò)酸(pH≤3)、過(guò)堿(pH≥10)、有機(jī)試劑及胰蛋白酶敏感;60℃作用30min可被滅活;最適培養(yǎng)細(xì)胞系為EPC和GCO,最適培養(yǎng)溫度范圍為25℃-28℃;在25℃條件下感染EPC細(xì)胞,12-24h內(nèi)病毒增殖速度達(dá)最大,36h后病毒增殖速度減緩,在72-96 h則進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期�；诟咄繙y(cè)序技術(shù),采用HiSeq2000測(cè)序儀對(duì)RNRV進(jìn)行了全基因組測(cè)序。結(jié)果顯示,該病毒基因組序列全長(zhǎng)為104286 bp,包括104個(gè)ORFs,其中已知功能的有55個(gè),未知功能的有49個(gè),它們所編碼蛋白的氨基酸長(zhǎng)度在41-1293AA之間,分子量在4.4-140.8KDa之間,整個(gè)基因組GC含量為55.2%,且在基因組序列中的79069-79186bp位置間存在59個(gè)CA重復(fù)。通過(guò)點(diǎn)陣分析發(fā)現(xiàn)RNRV基因組與RGV最為相似;以RNRV 26個(gè)核心基因編碼蛋白的串聯(lián)氨基酸序列與其他14株虹彩病毒相關(guān)序列根據(jù)鄰近法共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn),RNRV歸屬于蛙病毒屬FV3病毒類(lèi)群,且在進(jìn)化關(guān)系上與分離自中國(guó)的RGV、STIV的親緣關(guān)系最近。
【圖文】：

質(zhì)囊膜約厚4nm，其表面鑲嵌著內(nèi)層囊膜蛋白（Intramembranousproteioxvirus）相似，該內(nèi)層囊膜可能來(lái)源自宿主細(xì)胞的高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，配和病毒感染方面參與重要作用[29]；病毒衣殼由衣殼蛋白亞單位排列位主要由主要衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）組成，該蛋白是保守的結(jié)構(gòu)蛋白，大小約為48kDa，一般情況下能占到病毒總蛋白的45%的囊膜位于粒子的最外層，是病毒出芽過(guò)程中從宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜釋放蛙病毒區(qū)別于其他DNA 病毒的一個(gè)重要特征，同時(shí)囊膜中存在有能夠與入侵能力的受體結(jié)合蛋白[31]，這對(duì)有囊膜病毒對(duì)宿主的感染力的提用。蛙病毒在感染宿主細(xì)胞時(shí)，，通常會(huì)在胞漿中形成一片電子密度較淺毒的DNA 與編碼好的病毒衣殼蛋白在該區(qū)域組裝成一個(gè)完整的病毒顆粒在胞漿中游離或聚集成整齊的晶格狀結(jié)構(gòu)（Paracrystallinearray），該的照射下呈藍(lán)紫色虹彩，故名虹彩病毒，且電子顯微鏡下的晶格狀排列病毒的典型特征之一。

剖檢可見(jiàn)腹腔內(nèi)有淡黃色腹水，肝腫大充血，腸道空虛且腔內(nèi)充有大量黏液，脾腫大（圖2.1 C、D）�；疾◎蝌襟w表粘液與腸腔內(nèi)均未檢測(cè)到寄生蟲(chóng)存在；患病蝌蚪肝臟與腹水的組織涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢也未觀察到細(xì)菌。圖 2.1 患病蝌蚪臨床癥狀。A、B 為患病蝌蚪體表癥狀，箭頭所示位置可見(jiàn)腹部腫脹，體表多處出血，C、D 為患病蝌蚪剖解病變，箭頭所示為肝腫大出血。Fig.2.1 Clinical symptoms of moribund tadpoles. A, B represent symptoms of diseased tadpoles’ bodysurface, the arrowhead area shows swollen abdomen and hemorrhage on body surface. C, D representsymptoms of diseased tadpoles’ inner organs. the arrowhead area shows congestion and swelling of theliver.20
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2705304