發(fā)布時(shí)間：2020-06-08 16:13

【摘要】：解淀粉芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌,與枯草芽孢桿菌的親緣性較高,其代謝產(chǎn)物包括淀粉酶、蛋白酶和多種抗菌物質(zhì)�，F(xiàn)有研究表明,解淀粉芽孢桿菌TL具有與金霉素類似的促進(jìn)肉雞生長的效果,并能促進(jìn)肉雞蛋白質(zhì)的合成,脂類的代謝。在免疫器官指數(shù)方面,解淀粉芽孢桿菌TL可以刺激肉雞免疫器官的生長發(fā)育。本研究旨在通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌TL對(duì)生長前期肉雞回腸組織基因表達(dá)的影響,分析回腸組織基因表達(dá)與促生長機(jī)制之間聯(lián)系。益生菌組在基礎(chǔ)日糧中添加解淀粉芽孢桿菌TL,抗生素組在基礎(chǔ)日糧中添加金霉素,對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧。試驗(yàn)結(jié)果如下:1.基因表達(dá)水平分析:以FPKM1作為基因表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn),對(duì)照組表達(dá)的基因個(gè)數(shù)為14008,抗生素組表達(dá)的基因個(gè)數(shù)為14211,益生菌組表達(dá)的基因個(gè)數(shù)為14402。有13600個(gè)基因在三個(gè)組中都有表達(dá),其中,對(duì)照組獨(dú)特表達(dá)的基因個(gè)數(shù)為158,抗生素組獨(dú)特表達(dá)的基因個(gè)數(shù)為137,益生菌組獨(dú)特表達(dá)的基因個(gè)數(shù)為252。以FPKM500作為高豐度表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn),對(duì)照組高豐度表達(dá)基因有172個(gè),益生菌組高豐度表達(dá)基因有166個(gè),抗生素組高豐度表達(dá)基因有199個(gè)。其中,丙酮酸激酶(PKM)、前胸腺素(PTMA)和熱應(yīng)激蛋白(HSPs)在益生菌組和抗生素組高表達(dá),在對(duì)照組非高表達(dá)。結(jié)果提示益生菌組和抗生素組能量代謝速率快,免疫器官發(fā)育較早,抗氧化抗應(yīng)激能力強(qiáng)。2.差異表達(dá)基因篩選:以log_2fold change≥l或log_2fold change≤-1,且FDR(False discovery rate)0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)確定差異表達(dá)基因。其中,log_2fold change≥l且FDR0.05的基因確定為上調(diào)表達(dá)基因,log_2fold change≤-1且FDR0.05的基因確定為下調(diào)表達(dá)基因�？股亟M與對(duì)照組相比,共檢測到141個(gè)差異表達(dá)基因,上調(diào)表達(dá)基因3個(gè),下調(diào)表達(dá)基因138個(gè);益生菌組與對(duì)照組相比,共檢測到510個(gè)差異表達(dá)基因,上調(diào)表達(dá)基因163個(gè),下調(diào)表達(dá)基因347個(gè)�？股亟M相對(duì)益生菌組檢測到1個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析,結(jié)果提示益生菌組和抗生素組相同的差異表達(dá)基因在兩組中表達(dá)趨勢(shì)一致,并與對(duì)照組不一樣。因此,益生菌組與抗生素組在促進(jìn)肉雞生長方面有相似的作用機(jī)制。3.差異表達(dá)基因功能注釋分析:從差異表達(dá)基因的GO分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因功能主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、基因表達(dá)、離子運(yùn)輸、脂肪代謝等相關(guān),信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn):細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、胰島素信號(hào)通路、丁酰苷菌素和新霉素的生物合成、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解信號(hào)通路在兩組中聚集程度較高。分析解結(jié)果表明添加解淀粉芽孢桿菌TL后,病原減少,因此導(dǎo)致免疫刺激減少,最終免疫活動(dòng)減少和促進(jìn)脂肪沉積。4.差異表達(dá)基因驗(yàn)證:通過RT-qPCR法和體外細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證,試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),RT-qPCR檢測結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果基本一致,解淀粉芽孢桿菌TL刺激小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)可導(dǎo)致細(xì)胞的LEPR基因表達(dá)量上調(diào),說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和分析結(jié)果真實(shí)可靠。
【圖文】：

圖 2-1 轉(zhuǎn)錄組組分析流程Fig.2-1 The process of Transcriptome analysis2.4.1 cDNA 文庫構(gòu)建及 Illumina 測序用帶有 Oligo（dT）的磁珠，通過 A-T 互補(bǔ)配對(duì)與 mRNA 的 ployA 尾結(jié)合的方式富集真核生物的 mRNA。隨后加入 fragmentation buffer 將 mRNA 打斷成短片段，以 mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成一鏈 cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs 和 DNApolymerase I 合成二鏈 cDNA，隨后利用 AMPureXP beads 純化雙鏈 cDNA。純化的雙鏈 cDNA 再進(jìn)行末端修復(fù)、加 A 尾并連接測序接頭，然后用 AMPure XP beads 進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行 PCR 富集得到最終的 cDNA 文庫。文庫構(gòu)建原理如下圖（2-2）：

圖 2-2 文庫構(gòu)建（Marioni 2008）Fig.2-2 Library construction成后，先使用 Qubit2.0 進(jìn)行初步定量，，稀釋文庫至100 對(duì)文庫的插入片段長度（insert size）進(jìn)行檢測，-PCR 方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有。合格文庫采用 IlluminaHiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測序。序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng) CASAVA 堿基識(shí)別（B序序列（Sequenced Reads），也稱為 Raw Data 或 R檢查、 A/T/G/C 含量分布檢查后將數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，帶接頭(adapter)的 reads；去除 N（N 表示無法確定reads；去除低質(zhì)量 reads（Qphred <= 20 的堿基數(shù)占 reads）。其中，每個(gè)堿基測序錯(cuò)誤率是通過測序 Ph
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S831.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2703326