【摘要】：乳中最為重要的是乳蛋白和乳脂肪的含量以及組成,但我國牛奶中乳蛋白和乳脂肪的含量較低,尋找調(diào)控乳蛋白、乳脂肪關(guān)鍵信號(hào)分子為提高奶牛乳品質(zhì)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。METTL3(methyltransferase-like protein 3)也稱m~6A甲基轉(zhuǎn)移酶,能夠催化mRNA生成m~6A。大量研究表明METTL3通過調(diào)控mRNA中m~6A甲基化水平,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成起到重要的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果表明,METTL3通過調(diào)節(jié)mTOR和SREBP-1c基因的表達(dá),從而影響B(tài)MECs中乳蛋白、乳脂肪的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)擬研究METTL3促進(jìn)mTOR和SREBP-1c基因的表達(dá)和分子機(jī)制,以及p-GlyRS作用于METTL3的分子機(jī)制。甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)具有非經(jīng)典功能,通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀質(zhì)譜分析表明,GlyRS在胞核中以p-GlyRS的形式與其下游蛋白METTL3結(jié)合,實(shí)驗(yàn)室前期研究表明p-GlyRS可能具有激酶活性,p-GlyRS可能使METTL3磷酸化。從而激活METTL3,本研究揭示METTL3調(diào)控BMECs中乳蛋白、乳脂肪的分子機(jī)制以及p-GlyRS調(diào)控METTL3的分子機(jī)理。組織塊法獲取奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs),利用免疫熒光法及Western blotting(WB)檢測BMECs中CK18(Cytokeratin 18)和β-酪蛋白(β-casein)的表達(dá),對(duì)METTL3基因進(jìn)行過表達(dá)、干擾,WB實(shí)驗(yàn)檢測BMECs中β-casein的表達(dá)情況,同時(shí)利用甘油三酯試劑盒檢測BMECs中甘油三酯的表達(dá)。通過Dot blot實(shí)驗(yàn)檢測BMECs中mRNA m~6A的表達(dá)情況。RIP實(shí)驗(yàn)檢測METTL3靶蛋白mTOR和SREBP-1c的mRNA m~6A表達(dá)情況。FRET實(shí)驗(yàn),分析兩蛋白之間的相互作用。通過激光共聚焦共定位實(shí)驗(yàn),分析添加蛋氨酸和雌激素后p-GlyRS與METTL3相互作用有何變化。通過體外激酶實(shí)驗(yàn)檢測p-GlyRS能否激活GST-METTL3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明獲得了具有泌乳功能的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。METTL3過表達(dá)后,β-casein的表達(dá)量增加同時(shí)細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增多,脂滴體積變大,細(xì)胞中TAG合成量增加。而當(dāng)METTL3抑制時(shí),β-casein的表達(dá)量降低同時(shí)細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少,脂滴體積變小,細(xì)胞中TAG合成量降低。RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明METTL3過表達(dá)、干擾后BMECs中mTOR和SREBP-1c的mRNA m~6A表達(dá)增多、減少。FRET結(jié)果表明p-GlyRS與METTL3的FRET值大于20%,激光共定位實(shí)驗(yàn)表明,添加蛋氨酸和雌激素后p-GlyRS與METTL3的相互作用增加,體外激酶實(shí)驗(yàn)表明,p-GlyRS能夠使METTL3磷酸化。綜上所述,METTL3是BMECs中重要的信號(hào)分子,正向調(diào)控BMECs中乳蛋白和乳脂肪的合成。METTL3能夠正向調(diào)控mRNA m~6A水平,正向調(diào)控靶基因mTOR和SREBP-1c的mRNA m~6A水平。p-GlyRS與METTL3有直接相互作用,蛋氨酸和雌激素能夠促進(jìn)p-GlyRS與METTL3的結(jié)合。體外激酶活性實(shí)驗(yàn)表明p-GlyRS能夠使GST-METTL3磷酸化。以上實(shí)驗(yàn)有助于揭示METTL3調(diào)控BMECs中乳蛋白、乳脂肪的分子機(jī)制以及p-GlyRS調(diào)控METTL3的分子機(jī)理。
【圖文】：

可以觀察到成纖維細(xì)胞周圍有大量的呈橢圓形的乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生如圖3-1B，肉眼觀察瓶中的乳腺上皮細(xì)胞至 50%時(shí)，用 D-Hanks 吹掉組織塊，利用成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度不同，將成纖維消化掉，，分裝在另一瓶細(xì)胞瓶中如圖 3-1C，瓶中只剩下乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)過兩天的時(shí)間，得到純的乳腺上皮細(xì)胞如圖 3-1D。A：成纖維細(xì)胞； B：成纖維和乳腺上皮細(xì)胞；C：純化后的成纖維細(xì)胞； D：純化后的乳腺上皮細(xì)胞；圖 3-1 乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)與純化Fig. 3-1 Primary culture and purification of BMECs

圖 3-2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的 CK18 鑒定Fig. 3-2 Identification of BMECs of CK18 蛋白質(zhì)免疫印跡法鑒定 BMECsB 檢測兩種細(xì)胞中 CK18 與 CSN2 的表達(dá)。如圖 3-3，CK18 和 CSN2 在 B
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

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本文編號(hào)：2702686