【摘要】：哺乳動物卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)程起始于胎兒發(fā)育時期所形成的初級卵母細(xì)胞,并被阻滯在第一次減數(shù)分裂的雙線期,該阻滯期可持續(xù)數(shù)年甚至數(shù)十年之久。這種阻滯于第一次減數(shù)分裂雙線期的初級卵母細(xì)胞,與周圍的前顆粒細(xì)胞共同組成原始卵泡。哺乳動物性成熟后,卵巢中的原始卵泡逐步開始發(fā)育成熟或閉鎖退化,其中在發(fā)育成熟的卵泡中的初級卵母細(xì)胞由未生長狀態(tài)生長為充分生長初級卵母細(xì)胞,充分生長初級卵母細(xì)胞在排卵前促性腺激素峰的作用下,恢復(fù)減數(shù)分裂進(jìn)程、完成第一次減數(shù)分裂,形成次級卵母細(xì)胞。緊接著,次級卵母細(xì)胞進(jìn)入第二次減數(shù)分裂進(jìn)程,并再次被阻滯在第二次減數(shù)分裂中期,直至受精。卵母細(xì)胞體外成熟研究結(jié)果表明,卵母細(xì)胞一旦脫離卵泡內(nèi)減數(shù)分裂阻滯的生理環(huán)境,就會自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂,而此時初級卵母細(xì)胞可能尚未達(dá)到胞質(zhì)的充分成熟,過早恢復(fù)并完成減數(shù)分裂,不利于支持卵母細(xì)胞后續(xù)發(fā)育。在體外培養(yǎng)條件下,應(yīng)用蛋白質(zhì)合成抑制劑、蛋白磷酸化抑制劑和環(huán)化腺苷酸類似物等物質(zhì)均有可能抑制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù),避免卵母細(xì)胞的過早核成熟,使核成熟和胞質(zhì)成熟同步化。但是,上述非特異性抑制劑抑制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過早恢復(fù)的同時,會影響卵母細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和后續(xù)發(fā)育能力,最終其囊胚形成率與未經(jīng)抑制劑處理的卵母細(xì)胞相似,并不能有效提高卵母細(xì)胞的利用效率。C型鈉鈦(C-type natriuretic peptide)為鈉尿肽家族成員之一,于1990年在豬的大腦中得以分離純化。最近的研究表明,CNP是小鼠卵泡中天然存在的、能夠維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的關(guān)鍵物質(zhì),卵丘細(xì)胞鈉肽受體2(Natriuretic peptide receptor 2,NPR2)是CNP在卵泡的特異性受體。在豬上的研究結(jié)果也表明,CNP能夠維持卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂阻滯狀態(tài),使卵母細(xì)胞核成熟和胞質(zhì)成熟同步化,進(jìn)而提高卵母細(xì)胞的成熟率和胚胎發(fā)育能力。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果顯示,CNP能夠促進(jìn)牛卵母細(xì)胞的體外成熟和孤雌激活胚胎的囊胚形成率,但CNP促進(jìn)牛卵母細(xì)胞發(fā)育能力的分子機(jī)制還不清楚。本研究在檢測牛不同發(fā)育階段卵泡中Npr2 mRNA表達(dá)的基礎(chǔ)上,結(jié)合雌激素對Npr2mRNA表達(dá)的影響,利用牛卵母細(xì)胞和孤雌激活胚胎的體外成熟培養(yǎng)體系,研究CNP對牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程和發(fā)育能力的作用和機(jī)制。1.利用自制針梳分離法分離屠宰場來源牛卵巢中不同發(fā)育階段的腔前卵泡。分離結(jié)果顯示,分離得到的直徑50~100μm的腔前卵泡數(shù)量最多,直徑為100~200μm的卵泡數(shù)量次之,直徑為200μm以上的卵泡數(shù)量最少。2.利用反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和凝膠電泳技術(shù),以及實(shí)時定量PCR(quantificational real-time PCR,qRT-PCR)技術(shù)檢測牛卵巢內(nèi)不同發(fā)育階段卵泡中Npr2 mRNA的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示,在牛原始卵泡中未檢測到Npr2 mRNA的表達(dá);在初級卵泡、次級卵泡和不同直徑大小的有腔卵泡中均檢測到Npr2 mRNA的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示,Npr2 mRNA的表達(dá)水平隨卵泡發(fā)育而逐漸升高。3.利用常規(guī)PCR和凝膠電泳技術(shù),分別對牛的有腔卵泡內(nèi)壁顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中Npr2 mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,在卵泡壁顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均檢測到Npr2 mRNA的表達(dá)。4.利用卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)和qRT-PCR技術(shù)研究雌激素對體外培養(yǎng)的牛卵丘-卵母細(xì)胞(cumulus-oocyte complexs,COCs)Npr2 mRNA表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示,在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中,對照培養(yǎng)的COCs中Npr2 mRNA表達(dá)量隨著體外培養(yǎng)的進(jìn)行逐漸下降;而成熟培養(yǎng)液中分別添加10 ng/mL,100 ng/mL和1000 ng/mL17β-雌二醇(17 beta estradiol,17β-E2)時,均能不同程度地延緩Npr2 mRNA表達(dá)水平的下降,其中100 ng/mL17β-E2培養(yǎng)組能夠顯著維持COCs中Npr2 mRNA的表達(dá)。5.牛COCs在添加20 nmol/L,40 nmol/L,80 nmol/L和160 nmol/L CNP的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)4 h和6 h后,檢測卵母細(xì)胞核所處的減數(shù)分裂階段。結(jié)果顯示,CNP未顯著影響牛卵母細(xì)胞GVBD的發(fā)生。6.牛COCs在添加20 nmol/L CNP的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h,之后轉(zhuǎn)入常規(guī)培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h,能顯著提高牛卵母細(xì)胞體外成熟率和孤雌胚胎的發(fā)育率(P0.05)。7.利用qRT-PCR技術(shù)對孤雌激活囊胚發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,CNP的添加能夠顯著提高H19和Bmp15的表達(dá)水平(P0.05),而Xist和Slc16a2的表達(dá)量在兩組間差異不顯著(P0.05)。8.利用ELISA技術(shù)檢測牛COCs中環(huán)化鳥苷酸(cyclic guanylic monophosphate,c GMP)濃度。結(jié)果顯示,牛COCs中c GMP濃度隨體外培養(yǎng)時間的延長而不斷降低,而CNP能夠暫時性維持牛COCs中cGMP濃度。上述研究結(jié)果表明,牛卵巢中不同發(fā)育階段卵泡Npr2 mRNA表達(dá)水平存在明顯差異;牛有腔卵泡內(nèi)壁顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均有Npr2 mRNA表達(dá);雌激素可相對減緩體外培養(yǎng)COCs內(nèi)Npr2 mRNA表達(dá)水平的下降;CNP對體外成熟培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程無顯著影響,但能夠暫時性維持COCs中cGMP濃度,進(jìn)而為卵母細(xì)胞發(fā)育提供適宜濃度的環(huán)化腺苷酸(cyclic adenoson monophosphate,cAMP),從而顯著提高牛卵母細(xì)胞體外成熟率和孤雌胚胎的發(fā)育率。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S814

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本文編號：2700178