【摘要】：黑素皮質(zhì)素受體3(The melanocortin-3 receptor,MC3R)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs),其立體構(gòu)象中有七次α螺旋跨膜區(qū)。該受體被證實(shí)在維持動(dòng)物機(jī)體能量平衡、維持鈉平衡、參與免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)體晝夜節(jié)律等方面起到重要作用。目前,有關(guān)人、小鼠和豬等哺乳動(dòng)物的MC3R及其突變體的體外活性研究已有報(bào)道,但對(duì)于禽類的MC3R,目前的研究主要集中于基因多態(tài)性和經(jīng)濟(jì)性狀間的關(guān)系,而關(guān)于禽類MC3R以及其突變型的生理活性的研究較少。為了更深層次的研究雞MC3R(cMC3R)的功能,了解受體和配體的相互作用規(guī)律,同時(shí)為進(jìn)一步的藥物篩選或育種優(yōu)化等提供依據(jù),我們構(gòu)建了 cMC3R的真核表達(dá)載體,并根據(jù)已有研究報(bào)道中基因多態(tài)性與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系選取了四個(gè)突變位點(diǎn)即:M54L、G104S、L151R和S183S,通過(guò)單點(diǎn)突變技術(shù)獲得這四個(gè)突變體,將這5個(gè)真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入人腎上皮細(xì)胞系(Human Embryonic Kidney Tcells,HEK293T)中,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同基因型受體的胞內(nèi)總表達(dá)和細(xì)胞表面表達(dá)水平;利用125Ⅰ標(biāo)記的NDP-MSH進(jìn)行放射性配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究cMC3R WT和四個(gè)突變與不同配體的結(jié)合能力;利用雙報(bào)告基因法和Western Blot測(cè)定了激動(dòng)劑作用下cMC3R WT(wild type)和四個(gè)突變體對(duì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)與磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 1/2(phosphorylated Extracellular regulated protein kinases 1/2,pERK1/2)水平的影響,以此了解cMC3R基因突變對(duì)其受體體外生理功能的影響。結(jié)果如下:1、設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物,得到cMC3RWT全長(zhǎng)序列,將其連接到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體得到pcDNA3.1(+)-myc/cMC3R-WT。利用點(diǎn)突變技術(shù)以pcDNA3.1(+)-myc/cMC3R-WT質(zhì)粒為模板構(gòu)建單點(diǎn)突變,成功獲得4個(gè)突變型cMC3R的真核表達(dá)載體。2、將野生型和突變型cMC3R真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,流式細(xì)胞儀測(cè)定蛋白表達(dá),Triton X-100將細(xì)胞膜打孔檢測(cè)胞內(nèi)總蛋白表達(dá)水平,不打孔的細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)水平。結(jié)果顯示,cMC3R四個(gè)突變體的細(xì)胞表面表達(dá)和胞內(nèi)總表達(dá)與WT相比均無(wú)顯著性差異。3、用瞬時(shí)表達(dá)野生型和突變型cMC3Rs的細(xì)胞進(jìn)行放射性配體受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn),分別用激動(dòng)劑NDP-、α-、β-、γ-、和D-Trp8-γ-MSH與拮抗劑AGRP與125I-NDP-MSH競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體。結(jié)果顯示G104S突變幾乎喪失與各配體結(jié)合的能力,L151R與配體的親和力顯著上升,M54L和S183S的配體結(jié)合能力與WT無(wú)顯著性差異。4、將野生型和突變型cMC3R真核表達(dá)載體與螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒按固定比例轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞,檢測(cè)胞內(nèi)基礎(chǔ)cAMP水平,結(jié)果顯示,M54L和S183S的胞內(nèi)基礎(chǔ)cAMP水平與WT相比無(wú)顯著性差異,G104S和L151R與WT相比顯著性下降;同時(shí)分別選用不同濃度水平的激動(dòng)劑或拮抗劑在轉(zhuǎn)染后進(jìn)行刺激再檢測(cè)胞內(nèi)cAMP水平,在不同濃度配體的刺激下,WTcCM3R的cAMP水平隨著激動(dòng)劑濃度的增加而上升、隨著拮抗劑濃度的上升而下降,在同樣濃度的配體刺激下,M54L和S183S的活性與WTcMC3R相似,而G104S和L151R對(duì)配體響應(yīng)的靈敏度下降。5、將帶有野生型和突變型cMC3Rs基因轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,提取總蛋白,利用Western Blot檢測(cè)胞內(nèi)磷酸化ERK1/2基礎(chǔ)和配體誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示,G104S的胞內(nèi)磷酸化ERK1/2水平與WT相比有明顯下降,但經(jīng)過(guò)配體誘導(dǎo)后的四種突變的磷酸化ERK1/2水平則與野生型沒(méi)有顯著性差異;M54L、L151R和S183S的磷酸化ERK1/2水平與WTcMC3R無(wú)顯著性差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)AGRP是一種cMC3R的偏向激動(dòng)劑。
【圖文】：

等分類會(huì)有很多種分類方法。目前通用的分類方式將ＧＰＣＲ分為６種亞型，這種分類方式逡逑可以覆蓋包括脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物在內(nèi)的所有ＧＰＣＲ［５］。逡逑圖１－１邋Ｇ蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)示意圖逡逑ｆｆｉ體逡逑受體邋Ｉ邋ｒｊＨ？逡逑ｉ邋Ｇ強(qiáng)白逡逑Ｆｉｇｌ－１邋ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆＧ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ邋Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ逡逑（弓Ｉ邋自邋ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅ．ｓｏ．ｃｏｍ）逡逑１．２．１紫紅質(zhì)樣受體家族逡逑紫紅質(zhì)樣受體家族又叫視紫紅質(zhì)樣受體，是ＧＰＣＲ中最大的一個(gè)亞家族，其受體也是逡逑目前為止研究最多的。紫紅質(zhì)樣受體家族的受體結(jié)構(gòu)有很多相似之處，例如，第七個(gè)跨膜逡逑區(qū)包含ＮｓｘｘＮＰｘｘＹ保守序列，第三個(gè)跨膜區(qū)與第二個(gè)內(nèi)環(huán)交界處會(huì)有Ｄ（Ｅ）－Ｒ－Ｙ（Ｆ）保守序逡逑列等等Ｗ。逡逑１．２．２分泌素受體家族逡逑由于第一個(gè)被克隆成功的分泌受體屬于此受體家族的一員，所以將這個(gè)類型的受體命逡逑名為分泌素家族受體。分泌素家族受體的氨基酸具有高度相似性，通常以旁分泌的形式分逡逑泌，可以與許多的多肽配體結(jié)合■＝分泌素受體的Ｎ端一般包含６０－８０個(gè)氨基酸，通常會(huì)出逡逑現(xiàn)保守性非常高的半胱氨酸橋，此結(jié)構(gòu)對(duì)于與配體結(jié)合的能力非常重要【６］。逡逑１．２．３代謝型谷氨酸受體逡逑代謝型谷氨酸受體的配體識(shí)別區(qū)域位于２８０至５８０氨基酸的Ｎ末端

逑：ｈ卜…＇逡逑圖２－１邋ｃＭＣ３Ｒ基因ＰＣＲ電泳圖逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｃＭＣ３Ｒ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ，邋Ｔｒａｎｓ２Ｋ？邋Ｐｌｕｓ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－６，邋ｃＭＣ３Ｒ邋擴(kuò)增產(chǎn)物；逡逑Ｍ，邋Ｔｒａｎｓ２Ｋ？邋Ｐｌｕｓ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１－６，邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｃＭＣ３Ｒ逡逑３．２重組ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－／ｃＭＣ３Ｒ－ＷＴ的雙酶切和測(cè)序結(jié)果逡逑對(duì)重組真核表達(dá)載體ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｍｙｃ／ｃＭＣ３Ｒ－ＷＴ小提質(zhì)粒利用￡0？／？／和沿ｗ／雙酶逡逑切進(jìn)行雙酶切鑒定，，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見(jiàn)圖中約１０００邋ｂｐ出現(xiàn)目的大小的明亮條帶，逡逑與ｃＭＣ３Ｒ編碼區(qū)序列大小一致，將條帶大小正確的質(zhì)粒測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果如圖２－３。逡逑３０００逡逑２０００逡逑圖２－２重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃＭＣ３Ｒ邋ｄｏｕｂｌｅ邋Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ邋ｐｒｏｄｕｃｔ逡逑Ｍ，Ｔｒａｎｓ２Ｋ？ＰｌｕｓＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１－４，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃＭＣ３Ｒ邋雙酶切產(chǎn)物；５，陽(yáng)性對(duì)照；６，陰性對(duì)逡逑照逡逑Ｍ？邋Ｔｒａｎｓ２Ｋ？邋Ｐｌｕｓ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋ｌ－５？邋ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃＭＣ３Ｒ邋ｄｏｕｂｌｅ邋Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ邋ｐｒｏｄｕｃｔ；邋５，邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S831

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王霞;劉曉丹;于曉明;;鳳尾雞冠花耐鹽突變體的RAPD鑒定[J];吉林農(nóng)業(yè);2016年23期

2 王振業(yè);;水稻類病斑突變體研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)世界;2015年06期

3 全瑞蘭;王青林;馬漢云;扶定;霍二偉;沈光輝;郭桂英;;水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(bào);2015年12期

4 顧玉成,吳金平;利用離體培養(yǎng)技術(shù)篩選抗病突變體的研究進(jìn)展[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2004年02期

5 舒翠玲,郭燕翔,胡美茹,欒堯,沈倍奮;人CD28分子突變體的構(gòu)建和表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1999年02期

6 程淵,沈子威,趙南明,孫彤,王敖金,胡坤生;蜂毒突變體對(duì)紫膜質(zhì)子泵功能的影響[J];生物物理學(xué)報(bào);1997年01期

7 劉士輝,黃培堂,黃翠芬;組織型纖溶酶原激活劑突變體的構(gòu)建、表達(dá)及特性分析[J];中國(guó)科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1995年04期

8 周松茂,李代璽,徐光華;水稻輻射突變體遺傳變異的初步研究[J];遺傳;1985年02期

9 丁小令;矮桿、優(yōu)質(zhì)的水稻突變體[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);1986年01期

10 K.S.McKenzie;金衛(wèi);;一個(gè)水稻長(zhǎng)粒型品種的半矮稈突變體[J];核農(nóng)學(xué)通報(bào);1987年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 易小平;陳芳遠(yuǎn);盧升安;周開(kāi)達(dá);;空間環(huán)境誘發(fā)水稻突變體特異親和性研究[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展（上冊(cè)）[C];1999年

2 楊曉璐;謝慶軍;馮健;鄭華坤;董國(guó)軍;錢(qián)前;左建儒;;水稻細(xì)胞分裂素反應(yīng)異常突變體的篩選和基因克隆[A];2011全國(guó)植物生物學(xué)研討會(huì)論文集[C];2011年

3 胡天岑;王奎鋒;李連維;陳靜;蔣華良;沈旭;;SARS冠狀病毒3CL蛋白酶突變體的結(jié)構(gòu)對(duì)其聚合-活性關(guān)系的提示[A];中國(guó)晶體學(xué)會(huì)第四屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議學(xué)術(shù)論文摘要集[C];2008年

4 郝建平;郭美麗;裴雁曦;;擬南芥抗鹽突變體的RAPD分析[A];2004年北方七省市植物學(xué)年會(huì)論文集[C];2004年

5 林植芳;彭長(zhǎng)連;徐信蘭;林桂珠;張景六;;兩個(gè)新的水稻缺葉綠素b突變體光合作用的熱穩(wěn)定性[A];中國(guó)植物生理學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

6 何俊瑜;朱誠(chéng);蔣德安;陳靜;孫宗修;;水稻突變體對(duì)鎘的反應(yīng)及其對(duì)鎘的積累、分配特性[A];中國(guó)植物生理學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

7 王芳;崔鵬娟;黃蕓;王志文;王海峰;陳益芳;;玉米磷吸收和再分配的分子機(jī)制[A];2018全國(guó)植物生物學(xué)大會(huì)論文集[C];2018年

8 邊志遠(yuǎn);楊濤;高振晟;廉玉科;軒利娟;張燕;康繼紅;王新宇;王崇英;;擬南芥AtHSPR基因參與水楊酸介導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)[A];2018全國(guó)植物生物學(xué)大會(huì)論文集[C];2018年

9 羅晨薇;程家森;謝甲濤;陳桃;姜道宏;付艷萍;;盾殼霉產(chǎn)孢缺陷突變體的分析[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2016年

10 賈嬌;邢繼紅;董金皋;;擬南芥抗核盤(pán)菌突變體的篩選[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前4條

1 本報(bào)記者 劉洋;尋找“美麗的偶然”[N];東方煙草報(bào);2014年

2 記者 李天舒;玉米中可提取抗艾物質(zhì)[N];健康報(bào);2010年

3 《知識(shí)分子》公眾號(hào)主筆 邸利會(huì);基因編輯作物在中國(guó)該如何監(jiān)管[N];科技日?qǐng)?bào);2018年

4 科綜;水稻“長(zhǎng)生不老”可被制約[N];大眾科技報(bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王日欣;家蠶體形突變體樽蠶（tub）的定位克隆及分子機(jī)制探析[D];西南大學(xué);2018年

2 王閔霞;水稻分蘗調(diào)控基因OsIAA16的功能研究和d14突變體遺傳修飾因子的創(chuàng)制[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

3 劉振偉;水稻植株形態(tài)突變體（pad）的基因克隆與功能研究[D];武漢大學(xué);2014年

4 劉凱;水稻硼缺陷突變體的基因克隆及其功能分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 王超;擬南芥FIP1基因調(diào)控硝態(tài)氮信號(hào)的分子機(jī)理[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 呂銘輝;BR突變體bri1-301溫度依賴性缺陷表型的研究以及一個(gè)BR途徑新調(diào)控元件的鑒定[D];蘭州大學(xué);2018年

7 張東芝;擬南芥油菜素內(nèi)酯合成關(guān)鍵酶DWF4的功能研究[D];蘭州大學(xué);2018年

8 蘇巖;兩個(gè)水稻葉色控制基因的鑒定和功能分析[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

9 黃芳;擬南芥印記基因PKR2調(diào)控胚乳發(fā)育和合子后生殖隔離[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

10 李麟霄;擬南芥HIR基因的功能分析和atnop10突變體的鑒定[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李晶;紫花苜蓿（Medicago sativa L.）多雌突變體mp1的遺傳分析及細(xì)胞學(xué)觀察[D];蘭州大學(xué);2014年

2 張霞;一個(gè)水稻莖稈彎曲突變體的遺傳分析與基因定位[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 高緒強(qiáng);剪切流下WT-A1及其突變體介導(dǎo)的血小板鈣響應(yīng)[D];華南理工大學(xué);2018年

4 陳新;脫氮硫桿菌ATCC25259 SQR蛋白及突變體的結(jié)構(gòu)、相互作用分析及酶活性研究[D];華南理工大學(xué);2017年

5 姚鍇琳;分子改造提升嗜酸熱硫化葉菌MTSase酶活力研究[D];江南大學(xué);2018年

6 譚熙鈺;一種高過(guò)氧化氫耐受性脂肪酶突變體的構(gòu)建策略及其催化環(huán)氧化反應(yīng)的研究[D];華南理工大學(xué);2018年

7 王鵬杰;水稻早衰突變體es-32的理化鑒定與基因定位[D];浙江大學(xué);2017年

8 簡(jiǎn)磊;水稻白化轉(zhuǎn)綠突變體albg的鑒定和基因定位[D];浙江大學(xué);2017年

9 操詹魁;新城疫病毒HN糖蛋白頭頸部相互作用區(qū)基因突變分析[D];山東大學(xué);2018年

10 黃朝琨;鋁不敏感型擬南芥突變體的特征分析及突變基因篩選[D];廣西大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2698182