【摘要】：蜱,吸血性體外寄生蟲。寄生宿主范圍廣泛,包括哺乳類、兩棲類、禽類等。作為重要的傳播媒介之一,蜱在動物體表吸血過程中不僅對宿主動物的皮膚和血管造成機械性損傷,而且還會傳播細菌,病毒,無形體,原蟲等大量病原體。其在全球各地流行廣泛,對人類衛(wèi)生健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)引起嚴重的危害。至今,滅蜱廣泛依賴化學殺蟲劑,但長期使用化學類藥物導(dǎo)致耐藥性的逐漸增加,與此同時藥物殘留問題嚴重危及到食品安全和生態(tài)環(huán)境。隨著抗蜱疫苗分子的大力發(fā)展,蜱功能基因作為保護性抗原大量被挖掘,但蜱體內(nèi)病原體的多樣性特征以及復(fù)雜的生理特性可支配宿主動物免疫防御系統(tǒng),使得保護性抗原對蜱的控制效力不足。此外,這類抗蜱疫苗針對不同蜱的種類其抵抗力也不同。因此了解蜱生理發(fā)育特征以及蜱和蜱傳病原體之間的相互關(guān)系可以為防控蜱和預(yù)防蜱傳病提供科學理論依據(jù)。本研究對中國廣西地區(qū)采集的蜱樣品進行鑒定并統(tǒng)計種類及數(shù)量,同時利用反向線性斑點雜交技術(shù)檢測該地區(qū)蜱體內(nèi)梨形蟲感染情況;以褐黃血蜱為研究對象,通過實驗室飼養(yǎng)并收集不同發(fā)育階段蟲體,描述形態(tài)學超微結(jié)構(gòu),研究其生活史及生物學特性,針對蜱保守基因進行了不同蜱種類之間系統(tǒng)進化分析;利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對幼蜱和若蜱兩個不同發(fā)育階段蟲體進行差異基因表達分析;基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,從若蜱體內(nèi)鑒定克隆出半胱氨酸蛋白酶編碼基因HfCL,進行在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平分析和不同組織中的定位分析,同時對重組蛋白rHfCL的酶活性及其體外抑制巴貝斯蟲的特性等進行了研究。主要結(jié)果如下:(1)形態(tài)學鑒定中國廣西34個地區(qū)671份蜱樣品,其中有血紅扇頭蜱R.sanguineus64.08%(430),鐮形扇頭蜱R.haemaphysaloides 1.64%(11),長角血蜱H.longicornis32.63%(219),微小牛蜱R.microplus 1.34%(9),具角血蜱H.cornigera 0.29%(2);利用梨形蟲18s rRNA基因種屬特異性引物和探針,反向線性斑點雜交檢測蜱體內(nèi)梨形蟲攜帶情況,該調(diào)查地區(qū)蜱體內(nèi)主要攜帶沃氏巴貝斯蟲B.vogeli,水牛泰勒蟲T.buffeli,呂氏泰勒蟲T.luwenshuni,環(huán)形泰勒蟲T.annulatay其陽性率分別為3.13%(21),8.94%(60),0.89%(6),0.89%(6)。此外,蜱體內(nèi)梨形蟲混合攜帶的樣品有8份其陽性率為1.19%(8)。(2)通過飼養(yǎng)褐黃血蜱了解其生活史及生物學特性,其最適生長溫度為28±1℃,相對濕度88%,屬于三宿主蜱。針對不同發(fā)育階段的蜱形態(tài)學進行鑒定描述,其形態(tài)特征主要以軀體整體呈褐黃色,假頭基呈矩形其后部頸溝深,無眼,基突短而鈍,須肢短而包裹口下板,生殖孔呈心型,肛溝較深圍繞肛門后緣,肛門呈紐扣狀并左右分為兩個半月型,氣門板呈豆狀凸起,緣垛整齊均勻排列共11個,雌蜱盾板無斑點并呈亞圓形。以褐黃血蜱基因組DNA為模板,分別擴增克隆16s rRNA和cox 1基因序列,與同源物種序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,分析結(jié)果表明褐黃血蜱在不同地區(qū)的物種進化并無差異,與青海血蜱和臺灣血蜱的進化關(guān)系相近,形成一個獨立的分支,與扇頭蜱屬的蜱親緣關(guān)系較遠。(3)利用Illumina平臺進行RNA-seq分析褐黃血蜱饑餓幼蜱和若蜱兩個發(fā)育階段差異表達基因,結(jié)果表明,幼蜱和若蜱兩個文庫Raw Reads數(shù)量分別為62538796,71175770;Clean Reads數(shù)量分別為59871570、69519916。利用Nr、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫對拼接后的轉(zhuǎn)錄本進行功能注釋,獲得的Unigene經(jīng)過FPKM算法進行差異表達的分析,結(jié)果表明在若蜱發(fā)育階段上調(diào)的基因有56個,在幼蜱發(fā)育階段上調(diào)的基因有24個。差異基因主要集中在角質(zhì)蛋白,內(nèi)切幾丁質(zhì)酶,半胱氨酸蛋白酶,核酸內(nèi)切酶,核酸外切酶,蜱相關(guān)假定蛋白,脫氧核糖核酸酶,細胞色素酶,蛋白酶激活因子,半胱氨酸蛋白酶抑制劑等。(4)依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),從褐黃血蜱若蜱體內(nèi)克隆到半胱氨酸蛋白酶編碼基因HfCL,利用RACE方法獲得基因全長cDNA序列為1216 bp,其中包括CDS序列1041bp共編碼346個氨基酸,5’UTR部分38 bp,3’UTR部分137 bp。與同源氨基酸序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析表明,HfCL屬于木瓜蛋白家族蛋白酶的L型半胱氨酸蛋白酶。熒光定量PCR結(jié)果表明HfCL在卵和饑餓蟲體各個發(fā)育階段均有表達,其中若蜱和雌雄成蜱的表達量顯著高于幼蜱,而在卵發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平相對于幼蜱差異不顯著。隨后,原核表達HfCL基因CDS序列,分離純化重組蛋白rHfCL分子量為36 kDa并免疫小鼠獲得特異性多克隆抗體血清。免疫組化法檢測HfCL在蜱腸道和唾液腺中均有表達。通過水解半胱氨酸蛋白酶特異性熒光底物對重組蛋白rHfCL進行酶活性分析,結(jié)果表明在pH 6并且蛋白酶濃度在16μM條件下酶活性達到相對最大值。重組蛋白rHfCL體外抑制巴貝斯蟲試驗結(jié)果表明,不同濃度rHfCL抑制巴貝斯蟲裂殖體增長的效率也不同,100μg/mL濃度的重組蛋白rHfCL對田鼠巴貝斯蟲裂殖體增長抑制效果最佳,而250μg/mL濃度的重組蛋白rHfCL對吉氏巴貝斯蟲裂殖體抑制增長效果最佳。本研究首次通過反向線性斑點雜交技術(shù)對中國廣西蜱體內(nèi)感染梨形蟲潛在風險進行了評估;建立實驗室飼養(yǎng)褐黃血蜱平臺,掌握其生活史,生物學特性和形態(tài)學特征;利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析褐黃血蜱幼蜱若蜱兩個發(fā)育階段的差異表達基因;從褐黃血蜱若蜱體內(nèi)分離鑒定一種新型半胱氨酸蛋白酶并研究其功能,為蜱及蜱傳病的防控提供依據(jù)。
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華中農(nóng)業(yè)大學 2018 屆博士研究生學位論文細胞引起的疾病，如巴貝斯蟲病在畜牧養(yǎng)殖業(yè)危害較嚴重，其中牛巴貝斯蟲病主要是由微小牛蜱 Microplus boophilus，鐮形扇頭蜱 Rhipicephalus haemaphysaloides 等硬蜱寄生于牛體表使得宿主感染雙芽巴貝斯蟲 Babesia bigemina，東方巴貝斯蟲Babesia orientalis，牛巴貝斯蟲 Babesia bovis (Antunes et al., 2012; Bock et al., 1999;Huang et al., 2015)。經(jīng)蜱傳播的泰勒蟲主要寄生于哺乳動物紅細胞，巨噬細胞，淋巴細胞等具有較強的致病性 (Schnittger et al., 2000)。也有地區(qū)報道，經(jīng)蜱傳播的田鼠巴貝斯蟲感染人的案例 (Hildebrandt et al., 2007)。上述血液原蟲病引起的主要癥狀表現(xiàn)為食欲不振，，精神不振，貧血，消瘦，黃疸，發(fā)熱，嚴重者可以導(dǎo)致死亡(Srivastava and Sharma 1981; Terletsky and Akhmerova 2005)。萊姆病 Lyme borreliosis也是經(jīng)蜱感染的螺旋體自然疫源性疾病，主要在歐洲、北美洲，以及部分非洲地區(qū)的人類感染，臨床癥狀為皮膚呈游走性紅斑，心臟、神經(jīng)和關(guān)節(jié)等多系統(tǒng)、多臟器損害，其傳播媒介主要以蓖子硬蜱 Ixodes ricinus，肩突硬蜱 Ixodes scapularis 為主(Aguerorosenfeld et al., 1995; Kerr 2012)。

蜱可化分為一宿主，二宿主和三宿主蜱。生活史如（圖 1-2），成蜱尋找適宜宿主在其體表寄生吸食血液并完成交配，完全吸飽血的雄蟲離開宿主體表并死去，雌蟲吸飽血后離開動物體表開始尋找適宜的地方進行產(chǎn)卵；幼蜱是經(jīng)蟲卵胚胎發(fā)育孵化而來，具有一定活性的幼蜱找到適宜的宿主寄生并進行第一次吸血，完全飽血后離開宿主，經(jīng)蛻皮發(fā)育至若蜱；完全蛻皮后的若蜱待體內(nèi)血液消耗干凈再尋找新的宿主并進行第二次寄生吸血，蛻皮發(fā)育為成蜱。符合上述描述生活周期的蜱也稱為三宿主蜱。完整的生活周期中更換兩次宿主的蜱稱之為二宿主蜱，無需更換宿主的稱之為一宿主蜱。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.746

【參考文獻】

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1 曹允;;蜱的危害及防治措施研究進展[J];山東畜牧獸醫(yī);2015年02期

2 周勇志;曹杰;龔海燕;張厚雙;周金林;;長角血蜱孤雌生殖與兩性生殖種群的COⅠ基因序列的特征性差異[J];中國動物傳染病學報;2013年06期

3 呂繼洲;吳紹強;張永寧;王振寶;馮春燕;王彩霞;鄧俊花;袁向芬;林祥梅;;小亞璃眼蜱、亞洲璃眼蜱和殘緣璃眼蜱的分子生物學鑒定[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年06期

4 高東亞;田俊華;覃新程;王劍波;康雁君;張景山;周敦金;張居農(nóng);張永振;;褐黃血蜱與鈴頭血蜱的分子生物學鑒定[J];中國媒介生物學及控制雜志;2012年04期

5 楊曉軍;陳澤;劉敬澤;;蜱類系統(tǒng)學研究進展[J];昆蟲學報;2007年09期

6 周金林,周勇志,龔海燕,陳靈芝,曹杰;我國長角血蜱孤雌生殖種群的發(fā)現(xiàn)和生物學特性的研究[J];中國媒介生物學及控制雜志;2004年03期

7 段文元,邱宗文,張錫林;半胱氨酸蛋白酶在醫(yī)學寄生蟲學領(lǐng)域的研究進展[J];中國血吸蟲病防治雜志;2004年03期

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1 茍惠天;梨形蟲及硬蜱標識基因的分析與初步應(yīng)用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

2 賀蘭;東方巴貝斯蟲新型診斷方法的建立和基因組序列測定與分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2011年

3 陳澤;中國蜱類的系統(tǒng)分類及兩種硬蜱的生物學特性分析[D];河北師范大學;2010年

本文編號：2696849