【摘要】：蜱,吸血性體外寄生蟲。寄生宿主范圍廣泛,包括哺乳類、兩棲類、禽類等。作為重要的傳播媒介之一,蜱在動(dòng)物體表吸血過程中不僅對(duì)宿主動(dòng)物的皮膚和血管造成機(jī)械性損傷,而且還會(huì)傳播細(xì)菌,病毒,無形體,原蟲等大量病原體。其在全球各地流行廣泛,對(duì)人類衛(wèi)生健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)引起嚴(yán)重的危害。至今,滅蜱廣泛依賴化學(xué)殺蟲劑,但長(zhǎng)期使用化學(xué)類藥物導(dǎo)致耐藥性的逐漸增加,與此同時(shí)藥物殘留問題嚴(yán)重危及到食品安全和生態(tài)環(huán)境。隨著抗蜱疫苗分子的大力發(fā)展,蜱功能基因作為保護(hù)性抗原大量被挖掘,但蜱體內(nèi)病原體的多樣性特征以及復(fù)雜的生理特性可支配宿主動(dòng)物免疫防御系統(tǒng),使得保護(hù)性抗原對(duì)蜱的控制效力不足。此外,這類抗蜱疫苗針對(duì)不同蜱的種類其抵抗力也不同。因此了解蜱生理發(fā)育特征以及蜱和蜱傳病原體之間的相互關(guān)系可以為防控蜱和預(yù)防蜱傳病提供科學(xué)理論依據(jù)。本研究對(duì)中國(guó)廣西地區(qū)采集的蜱樣品進(jìn)行鑒定并統(tǒng)計(jì)種類及數(shù)量,同時(shí)利用反向線性斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)該地區(qū)蜱體內(nèi)梨形蟲感染情況;以褐黃血蜱為研究對(duì)象,通過實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)并收集不同發(fā)育階段蟲體,描述形態(tài)學(xué)超微結(jié)構(gòu),研究其生活史及生物學(xué)特性,針對(duì)蜱保守基因進(jìn)行了不同蜱種類之間系統(tǒng)進(jìn)化分析;利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)幼蜱和若蜱兩個(gè)不同發(fā)育階段蟲體進(jìn)行差異基因表達(dá)分析;基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,從若蜱體內(nèi)鑒定克隆出半胱氨酸蛋白酶編碼基因HfCL,進(jìn)行在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平分析和不同組織中的定位分析,同時(shí)對(duì)重組蛋白rHfCL的酶活性及其體外抑制巴貝斯蟲的特性等進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下:(1)形態(tài)學(xué)鑒定中國(guó)廣西34個(gè)地區(qū)671份蜱樣品,其中有血紅扇頭蜱R.sanguineus64.08%(430),鐮形扇頭蜱R.haemaphysaloides 1.64%(11),長(zhǎng)角血蜱H.longicornis32.63%(219),微小牛蜱R.microplus 1.34%(9),具角血蜱H.cornigera 0.29%(2);利用梨形蟲18s rRNA基因種屬特異性引物和探針,反向線性斑點(diǎn)雜交檢測(cè)蜱體內(nèi)梨形蟲攜帶情況,該調(diào)查地區(qū)蜱體內(nèi)主要攜帶沃氏巴貝斯蟲B.vogeli,水牛泰勒蟲T.buffeli,呂氏泰勒蟲T.luwenshuni,環(huán)形泰勒蟲T.annulatay其陽性率分別為3.13%(21),8.94%(60),0.89%(6),0.89%(6)。此外,蜱體內(nèi)梨形蟲混合攜帶的樣品有8份其陽性率為1.19%(8)。(2)通過飼養(yǎng)褐黃血蜱了解其生活史及生物學(xué)特性,其最適生長(zhǎng)溫度為28±1℃,相對(duì)濕度88%,屬于三宿主蜱。針對(duì)不同發(fā)育階段的蜱形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定描述,其形態(tài)特征主要以軀體整體呈褐黃色,假頭基呈矩形其后部頸溝深,無眼,基突短而鈍,須肢短而包裹口下板,生殖孔呈心型,肛溝較深圍繞肛門后緣,肛門呈紐扣狀并左右分為兩個(gè)半月型,氣門板呈豆?fàn)钔蛊?緣垛整齊均勻排列共11個(gè),雌蜱盾板無斑點(diǎn)并呈亞圓形。以褐黃血蜱基因組DNA為模板,分別擴(kuò)增克隆16s rRNA和cox 1基因序列,與同源物種序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析結(jié)果表明褐黃血蜱在不同地區(qū)的物種進(jìn)化并無差異,與青海血蜱和臺(tái)灣血蜱的進(jìn)化關(guān)系相近,形成一個(gè)獨(dú)立的分支,與扇頭蜱屬的蜱親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。(3)利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行RNA-seq分析褐黃血蜱饑餓幼蜱和若蜱兩個(gè)發(fā)育階段差異表達(dá)基因,結(jié)果表明,幼蜱和若蜱兩個(gè)文庫Raw Reads數(shù)量分別為62538796,71175770;Clean Reads數(shù)量分別為59871570、69519916。利用Nr、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫對(duì)拼接后的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋,獲得的Unigene經(jīng)過FPKM算法進(jìn)行差異表達(dá)的分析,結(jié)果表明在若蜱發(fā)育階段上調(diào)的基因有56個(gè),在幼蜱發(fā)育階段上調(diào)的基因有24個(gè)。差異基因主要集中在角質(zhì)蛋白,內(nèi)切幾丁質(zhì)酶,半胱氨酸蛋白酶,核酸內(nèi)切酶,核酸外切酶,蜱相關(guān)假定蛋白,脫氧核糖核酸酶,細(xì)胞色素酶,蛋白酶激活因子,半胱氨酸蛋白酶抑制劑等。(4)依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),從褐黃血蜱若蜱體內(nèi)克隆到半胱氨酸蛋白酶編碼基因HfCL,利用RACE方法獲得基因全長(zhǎng)cDNA序列為1216 bp,其中包括CDS序列1041bp共編碼346個(gè)氨基酸,5’UTR部分38 bp,3’UTR部分137 bp。與同源氨基酸序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,HfCL屬于木瓜蛋白家族蛋白酶的L型半胱氨酸蛋白酶。熒光定量PCR結(jié)果表明HfCL在卵和饑餓蟲體各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá),其中若蜱和雌雄成蜱的表達(dá)量顯著高于幼蜱,而在卵發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于幼蜱差異不顯著。隨后,原核表達(dá)HfCL基因CDS序列,分離純化重組蛋白rHfCL分子量為36 kDa并免疫小鼠獲得特異性多克隆抗體血清。免疫組化法檢測(cè)HfCL在蜱腸道和唾液腺中均有表達(dá)。通過水解半胱氨酸蛋白酶特異性熒光底物對(duì)重組蛋白rHfCL進(jìn)行酶活性分析,結(jié)果表明在pH 6并且蛋白酶濃度在16μM條件下酶活性達(dá)到相對(duì)最大值。重組蛋白rHfCL體外抑制巴貝斯蟲試驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度rHfCL抑制巴貝斯蟲裂殖體增長(zhǎng)的效率也不同,100μg/mL濃度的重組蛋白rHfCL對(duì)田鼠巴貝斯蟲裂殖體增長(zhǎng)抑制效果最佳,而250μg/mL濃度的重組蛋白rHfCL對(duì)吉氏巴貝斯蟲裂殖體抑制增長(zhǎng)效果最佳。本研究首次通過反向線性斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)中國(guó)廣西蜱體內(nèi)感染梨形蟲潛在風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估;建立實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)褐黃血蜱平臺(tái),掌握其生活史,生物學(xué)特性和形態(tài)學(xué)特征;利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析褐黃血蜱幼蜱若蜱兩個(gè)發(fā)育階段的差異表達(dá)基因;從褐黃血蜱若蜱體內(nèi)分離鑒定一種新型半胱氨酸蛋白酶并研究其功能,為蜱及蜱傳病的防控提供依據(jù)。
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華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆博士研究生學(xué)位論文細(xì)胞引起的疾病，如巴貝斯蟲病在畜牧養(yǎng)殖業(yè)危害較嚴(yán)重，其中牛巴貝斯蟲病主要是由微小牛蜱 Microplus boophilus，鐮形扇頭蜱 Rhipicephalus haemaphysaloides 等硬蜱寄生于牛體表使得宿主感染雙芽巴貝斯蟲 Babesia bigemina，東方巴貝斯蟲Babesia orientalis，牛巴貝斯蟲 Babesia bovis (Antunes et al., 2012; Bock et al., 1999;Huang et al., 2015)。經(jīng)蜱傳播的泰勒蟲主要寄生于哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等具有較強(qiáng)的致病性 (Schnittger et al., 2000)。也有地區(qū)報(bào)道，經(jīng)蜱傳播的田鼠巴貝斯蟲感染人的案例 (Hildebrandt et al., 2007)。上述血液原蟲病引起的主要癥狀表現(xiàn)為食欲不振，，精神不振，貧血，消瘦，黃疸，發(fā)熱，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡(Srivastava and Sharma 1981; Terletsky and Akhmerova 2005)。萊姆病 Lyme borreliosis也是經(jīng)蜱感染的螺旋體自然疫源性疾病，主要在歐洲、北美洲，以及部分非洲地區(qū)的人類感染，臨床癥狀為皮膚呈游走性紅斑，心臟、神經(jīng)和關(guān)節(jié)等多系統(tǒng)、多臟器損害，其傳播媒介主要以蓖子硬蜱 Ixodes ricinus，肩突硬蜱 Ixodes scapularis 為主(Aguerorosenfeld et al., 1995; Kerr 2012)。

蜱可化分為一宿主，二宿主和三宿主蜱。生活史如（圖 1-2），成蜱尋找適宜宿主在其體表寄生吸食血液并完成交配，完全吸飽血的雄蟲離開宿主體表并死去，雌蟲吸飽血后離開動(dòng)物體表開始尋找適宜的地方進(jìn)行產(chǎn)卵；幼蜱是經(jīng)蟲卵胚胎發(fā)育孵化而來，具有一定活性的幼蜱找到適宜的宿主寄生并進(jìn)行第一次吸血，完全飽血后離開宿主，經(jīng)蛻皮發(fā)育至若蜱；完全蛻皮后的若蜱待體內(nèi)血液消耗干凈再尋找新的宿主并進(jìn)行第二次寄生吸血，蛻皮發(fā)育為成蜱。符合上述描述生活周期的蜱也稱為三宿主蜱。完整的生活周期中更換兩次宿主的蜱稱之為二宿主蜱，無需更換宿主的稱之為一宿主蜱。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.746

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2696849