【摘要】：口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄類動物共患的烈性傳染疫病,對家畜養(yǎng)殖業(yè)和國際間的活畜貿(mào)易有著巨大威脅。針對口蹄疫病毒抗體進(jìn)行檢測是口蹄疫疫情監(jiān)測的主要手段之一,其中液相阻斷ELISA(liquid-phase blocking ELISA,LPB-ELISA)是O型口蹄疫病毒抗體檢測中重要方法,被廣泛應(yīng)用于疫苗評價和動物檢疫中,但其存在檢測通量低,耗時耗力等缺點(diǎn)。本試驗(yàn)開發(fā)了O型口蹄疫病毒抗體高通量液相阻斷CLIA方法(liquid-phase blocking CLIA,LPB-CLIA),在保留檢測準(zhǔn)確性的同時將檢測通量提高了5-10倍,并對檢測穩(wěn)定性做出了優(yōu)化,為我國口蹄疫防治提供了更經(jīng)濟(jì)高效的檢測方法。減少血清稀釋倍數(shù)是提高檢測通量的關(guān)鍵因素,為了確定試驗(yàn)最佳血清稀釋倍數(shù),在不同稀釋倍數(shù)下對不同效價的8份血清進(jìn)行檢測,考察各稀釋倍數(shù)的有效檢測范圍。結(jié)果表明,所有稀釋倍數(shù)下檢測范圍均在3-5個滴度內(nèi)。因此,為了保證檢測準(zhǔn)確性和檢測通量的最優(yōu)化,將血清分為高效價血清(效價大于等于1:128)和低效價血清(效價小于1:128)分別確定最佳稀釋倍數(shù)。通過90份低效價血清和54份高效價血清的檢測,確定8倍稀釋為低效價血清最佳稀釋倍數(shù),64倍稀釋為高效價血清最佳稀釋倍數(shù)。為了對檢測結(jié)果做出有效且有意義的解釋,本研究通過檢測大量血清,計(jì)算其抑制百分率(Percentage Inhibition,PI),并利用PI值的ROC曲線分析確定各效價血清間最佳臨界值,從而建立起PI值與效價的對應(yīng)關(guān)系,實(shí)現(xiàn)對檢測血清的準(zhǔn)確賦值。最終對兩個檢測體系建立了各自的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn),并對交叉部分(效價1:90及1:180)進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果表明88份血清中79份血清檢測結(jié)果一致,而9份異常血清中8倍檢測結(jié)果符合更好,因此,確定對于交叉部分血清以8倍稀釋檢測結(jié)果為準(zhǔn)。確定整個檢測體系后,對試驗(yàn)的重復(fù)性、敏感性和特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明試驗(yàn)PI值的批內(nèi)變異系數(shù)小于10%,批間變異系數(shù)小于15%,45份血清3次檢測效價平均標(biāo)準(zhǔn)差為0.03,具有很好的可重復(fù)性。通過檢測214份O型口蹄疫陽性血清和246份O型口蹄疫陰性血清,試驗(yàn)敏感性為98.5%、特異性為96.3%。檢測37份A型口蹄疫陽性血清和7份Asia I型陽性血清,均為陰性結(jié)果,表明試驗(yàn)無交叉反應(yīng)性。比較239份血清LPB-ELISA和LPB-CLIA的檢測結(jié)果,顯示兩種方法的相關(guān)系數(shù)為0.95,屬于高度相關(guān)。最后應(yīng)用本試驗(yàn)對6株不同的疫苗免疫效果進(jìn)行了跟蹤評價,結(jié)果表明本試驗(yàn)檢測的免疫動物抗體消長血清與LPB-ELISA檢測結(jié)果基本一致,可用于對疫苗質(zhì)量的評價和疫苗免疫程序的制定。本試驗(yàn)建立的O型口蹄疫抗體高通量液相阻斷CLIA檢測方法,可實(shí)現(xiàn)單一稀釋倍數(shù)定性檢測和雙稀釋倍數(shù)定量檢測,大幅提高了檢測通量和檢測效率,同時又保留了LPBELISA檢測的準(zhǔn)確性,可為口蹄疫大批量診斷提供更好的選擇。
【圖文】：

綜上所述可知，全球口蹄疫疫情不斷，距離徹底控制和消滅口蹄疫需要更為有效的防控手段。圖1-1 口蹄疫流行圈及2007年到2014年口蹄疫爆發(fā)事件[11]Fig.1-1 FMDV Pools and major highlight of FMDV events from 2007 to 20141.2 口蹄疫病毒口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，共有O、A、C、Asia I、SAT1、SAT2和SAT 3型7個血清型，每個型內(nèi)可分為眾多亞型。完整的FMDV粒子由單股正鏈RNA和4個結(jié)構(gòu)蛋白組成，，呈二十面體結(jié)構(gòu)。FMDV基因全長8.5kb，可分為5’非編碼區(qū)（5’UTR）、編碼區(qū)（ORF）、3’非編碼區(qū)（3’UTR）和polyA。5’UTR含有5個功能區(qū)，分別為S片段、polyC、偽節(jié)點(diǎn)、順勢作用元件和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internalribosomeentrysite，IRES），幫助病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄順利進(jìn)行。3’UTR可結(jié)合大量復(fù)制過程所需蛋白

第一章 緒論點(diǎn)所在，在O型FMDV中已發(fā)現(xiàn)有5個不同功能的抗原位點(diǎn)，其中VP1中含位點(diǎn)，G-H環(huán)和羧基段，是FMDV形成抗原免疫原性最重要的蛋白[17]。目通過外源表達(dá)VP1等抗原位點(diǎn)來制備口蹄疫疫苗[18, 19]。因此，對FMDV的理的深入研究可為FMD診斷技術(shù)開發(fā)和疫苗研制提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和路。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S855.3

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本文編號：2690342