【摘要】：綿羊是一種反芻肉用家畜,作為肉質(zhì)品質(zhì)的重要指標,其胴體脂肪含量是人們關注的熱點。降低綿羊胴體脂肪含量是肉羊遺傳改良的重要育種目標。解偶聯(lián)蛋白UCP2是UCPs家族成員之一,也是促進脂肪分解的關鍵蛋白之一,當機體開始以脂肪組織為主要能源物質(zhì)時,血液中的脂肪酸和酮體含量相應升高,脂肪酸會促進UCP2mRNA的表達,繼續(xù)加強脂肪的分解速度。MicroRNA(miRNA)通過調(diào)節(jié)功能基因?qū)d羊肉質(zhì)的影響也成為近年來的研究熱點。miRNA主要通過與靶基因mRNA的完全和不完全結(jié)合,使靶基因的mRNA表達量下降或者降解mRNA。培養(yǎng)和誘導分化綿羊前體脂肪細胞是研究miRNA調(diào)控綿羊脂肪代謝的有效手段,所以,鑒定綿羊前體脂肪細胞以及研究綿羊前體脂肪細胞分化過程中的影響因素是后續(xù)試驗進行的必要條件。本研究旨在探究tmiR-132-3p對綿羊前體脂肪細胞中UCP2基因的表達調(diào)控機制。通過添加不同濃度胰島素的培養(yǎng)基對綿羊前體脂肪細胞進行不同時長的處理,確定綿羊前體脂肪細胞出現(xiàn)胰島素抵抗的條件以及綿羊前體脂肪細胞分化過程中對不同濃度胰島素刺激的應答情況;然后利用油紅O染色和脂肪細胞分化標志基因的表達量對綿羊前體脂肪細胞的分化潛能進行鑒定:同時在綿羊前體脂肪細胞分化的不同時期,提取細胞的RNA,用RT-qPCR技術檢測綿羊前體脂肪細胞分化過程中miR-132-3p和UCP2的表達量;分別利用三個不同的生物信息學軟件分別預測可以與UCF2特異性結(jié)合的miRNAs,取交集得到可以潛在結(jié)合UCP2的miRNA;構(gòu)建UCP2 3'-UTR的雙熒光素報告載體pmirGLO-UCP2-3'-UTR,轉(zhuǎn)化Trans 5α感受態(tài)細胞,提取并純化重組質(zhì)粒;利用雙酶切技術、菌液PCR技術、測序技術對pmirGLO-UCP2-3'-UTR雙熒光素報告載體進行鑒定;將pmirGLO-UCP2-3'-UTR和miR-132-3p的mimics共轉(zhuǎn)染進HEK-293T細胞,檢測相對熒光活性,進而驗證miR-132-3p與UCP2的靶標關系;然后在綿羊前體脂肪細胞中過表達miR-132-3p的mimics并設立陰性對照NC組,提取總RNA和總蛋白后,用RT-qPCR、Westem blotting技術檢測過表達后UCP2 mRNA和蛋白的表達,同時檢測綿羊前體脂肪細胞分化過程中標志基因的表達量。(1)試驗發(fā)現(xiàn)誘導綿羊前體脂肪細胞分化的過程中標志基因的表達量逐漸上升。脂滴越來越多,越變越大,進行油紅O染色后,細胞輪廓清晰,胞漿內(nèi)可見紅色脂滴聚集,表明細胞具有分化為成熟綿羊脂肪細胞的潛能。通過添加不同濃度的胰島素試驗發(fā)現(xiàn)細胞在10-9mM、10-8mM濃度胰島素培養(yǎng)條件下,隨著胰島素濃度的升高,細胞對葡萄糖的吸收量也隨之增加。在10-7mM濃度胰島素培養(yǎng)條件下,24 h內(nèi)細胞對胰島素的刺激有明顯的應答反應,隨著處理時間增加,對葡萄糖的吸收量也相應增加,在處理48h時,細胞不能對胰島素的刺激做出正常反應,葡萄糖的吸收量也無明顯變化。10-6mM濃度的胰島素處理后的細胞活性開始降低,細胞的死亡率升高。說明綿羊前體脂肪細胞在10-9mM、10-8mM濃度胰島素培養(yǎng)條件下有劑量依賴性,10-7 mM濃度胰島素處理48h時出現(xiàn)胰島素抵抗。(2)生物信息學軟件預測得到可以與UCP2結(jié)合的miRNA有miR-132-3p和miR-212-3p,在雙酶切重組質(zhì)粒和菌液PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖上可以清晰地看到出現(xiàn)目的片段,說明重組質(zhì)粒中包含有UCP2 3'-UTR目的片段;重組質(zhì)粒與miR-132-3p共轉(zhuǎn)染后檢測到mimics組的相對熒光活性顯著低于(P0.05)NC組和Blank組的相對熒光活性,直接證明miR-132-3p可以與UCP2 3'-UTR結(jié)合,說明miR-132-3p和UCP2存在靶標關系。(3)綿羊前體脂肪細胞分化過程中miR-132-3p和UCP2基因的表達量在細胞分化的前期和中期呈現(xiàn)負相關關系。過表達miR-132-3p后,UCP2mRNA在過表達組中的表達量顯著低于(P0.05)陰性對照組,說明miR-132-3p對UCP2在mRNA水平上有負調(diào)控作用;Westernblot表明,UCP2蛋白在過表達組中的表達量顯著低于(P0.05)陰性對照組,說明miR-132-3p對UCP2在蛋白水平上也有負調(diào)控作用。
【圖文】：

２．１前體脂肪細胞的生長狀態(tài)逡逑對消化后的細胞進行培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的細胞大多只呈現(xiàn)出上皮樣細胞形態(tài)逡逑和成纖維細胞養(yǎng)形態(tài)，如圖２－ｌａ所示，６ｈ后在顯微鏡下觀察到的細胞緊貼培逡逑養(yǎng)皿底部生長，且出現(xiàn)了成梭形或者星形的細胞形態(tài)，，且有的細胞形態(tài)類似于逡逑長了兩三個觸角，初步確定本研究中培養(yǎng)的細胞為綿羊的前體脂肪細胞。圖逡逑２－ｌｂ所示為培養(yǎng)２邋ｄ后細胞長滿培養(yǎng)皿底部后的圖像。逡逑２４逡逑

Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｄｉｄ邋ｎｏｔ邋ｒｅｓｐｏｎｄ邋ｔｏ邋ｉｎｓｕｌｉｎ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ；邋Ｂ：邋Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋ｉｎｓｕｌｉｎ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ逡逑２．５前體脂肪細胞的分化和染色逡逑圖２－３顯示的是綿羊前體脂肪細胞不同分化時間點的細胞形態(tài)。圖中的ａ，逡逑ｂ，ｃ，ｄ分別代表細胞分化了邋２ｄ，４邋ｄ，邋６邋ｄ，邋８邋ｄ。可以直觀的看到，隨著綿羊逡逑前體脂肪細胞的分化天數(shù)，脂滴積少成多，且脂滴變得越來越大，填充在細胞逡逑之間。逡逑對其進行油紅０染色，可從圖２－４看出，圖中的ａ，邋ｂ，邋ｃ，邋ｄ分別代表細逡逑胞分化了邋２ｄ，４邋ｄ，邋６邋ｄ，邋８邋ｄ。油紅０所染的紅色面積隨著誘導分化的天數(shù)越逡逑來越大，且區(qū)域也越來越多。這些結(jié)果表明，培養(yǎng)的細胞隨著誘導分化的時間逡逑延長，出現(xiàn)的脂滴越來越多，且脂滴變得越來越聚集。由２ｄ的零星脂滴分布逡逑到８ｄ的脂滴聚集，以及大量脂滴生成來看，培養(yǎng)的細胞有分化出脂滴的能力，逡逑且?guī)缀跞糠只癁槌墒斓闹炯毎�。說明了本批采樣消化得到的細胞為前體脂逡逑肪細胞
【學位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S826

【參考文獻】

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1 陳翠;張立敏;陳曉杰;劉喜冬;張猛;李姣;袁崢嶸;張路培;高雪;高會江;李俊雅;許尚忠;;UCP2基因遺傳多態(tài)性與西門塔爾牛生長相關性狀的遺傳效應分析[J];畜牧獸醫(yī)學報;2012年05期

本文編號：2687818