【摘要】：綿羊是一種反芻肉用家畜,作為肉質(zhì)品質(zhì)的重要指標(biāo),其胴體脂肪含量是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。降低綿羊胴體脂肪含量是肉羊遺傳改良的重要育種目標(biāo)。解偶聯(lián)蛋白UCP2是UCPs家族成員之一,也是促進(jìn)脂肪分解的關(guān)鍵蛋白之一,當(dāng)機(jī)體開始以脂肪組織為主要能源物質(zhì)時,血液中的脂肪酸和酮體含量相應(yīng)升高,脂肪酸會促進(jìn)UCP2mRNA的表達(dá),繼續(xù)加強(qiáng)脂肪的分解速度。MicroRNA(miRNA)通過調(diào)節(jié)功能基因?qū)d羊肉質(zhì)的影響也成為近年來的研究熱點(diǎn)。miRNA主要通過與靶基因mRNA的完全和不完全結(jié)合,使靶基因的mRNA表達(dá)量下降或者降解mRNA。培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化綿羊前體脂肪細(xì)胞是研究miRNA調(diào)控綿羊脂肪代謝的有效手段,所以,鑒定綿羊前體脂肪細(xì)胞以及研究綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中的影響因素是后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行的必要條件。本研究旨在探究tmiR-132-3p對綿羊前體脂肪細(xì)胞中UCP2基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。通過添加不同濃度胰島素的培養(yǎng)基對綿羊前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行不同時長的處理,確定綿羊前體脂肪細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗的條件以及綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中對不同濃度胰島素刺激的應(yīng)答情況;然后利用油紅O染色和脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)量對綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化潛能進(jìn)行鑒定:同時在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化的不同時期,提取細(xì)胞的RNA,用RT-qPCR技術(shù)檢測綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中miR-132-3p和UCP2的表達(dá)量;分別利用三個不同的生物信息學(xué)軟件分別預(yù)測可以與UCF2特異性結(jié)合的miRNAs,取交集得到可以潛在結(jié)合UCP2的miRNA;構(gòu)建UCP2 3'-UTR的雙熒光素報告載體pmirGLO-UCP2-3'-UTR,轉(zhuǎn)化Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞,提取并純化重組質(zhì)粒;利用雙酶切技術(shù)、菌液PCR技術(shù)、測序技術(shù)對pmirGLO-UCP2-3'-UTR雙熒光素報告載體進(jìn)行鑒定;將pmirGLO-UCP2-3'-UTR和miR-132-3p的mimics共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293T細(xì)胞,檢測相對熒光活性,進(jìn)而驗(yàn)證miR-132-3p與UCP2的靶標(biāo)關(guān)系;然后在綿羊前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)miR-132-3p的mimics并設(shè)立陰性對照NC組,提取總RNA和總蛋白后,用RT-qPCR、Westem blotting技術(shù)檢測過表達(dá)后UCP2 mRNA和蛋白的表達(dá),同時檢測綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中標(biāo)志基因的表達(dá)量。(1)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)綿羊前體脂肪細(xì)胞分化的過程中標(biāo)志基因的表達(dá)量逐漸上升。脂滴越來越多,越變越大,進(jìn)行油紅O染色后,細(xì)胞輪廓清晰,胞漿內(nèi)可見紅色脂滴聚集,表明細(xì)胞具有分化為成熟綿羊脂肪細(xì)胞的潛能。通過添加不同濃度的胰島素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在10-9mM、10-8mM濃度胰島素培養(yǎng)條件下,隨著胰島素濃度的升高,細(xì)胞對葡萄糖的吸收量也隨之增加。在10-7mM濃度胰島素培養(yǎng)條件下,24 h內(nèi)細(xì)胞對胰島素的刺激有明顯的應(yīng)答反應(yīng),隨著處理時間增加,對葡萄糖的吸收量也相應(yīng)增加,在處理48h時,細(xì)胞不能對胰島素的刺激做出正常反應(yīng),葡萄糖的吸收量也無明顯變化。10-6mM濃度的胰島素處理后的細(xì)胞活性開始降低,細(xì)胞的死亡率升高。說明綿羊前體脂肪細(xì)胞在10-9mM、10-8mM濃度胰島素培養(yǎng)條件下有劑量依賴性,10-7 mM濃度胰島素處理48h時出現(xiàn)胰島素抵抗。(2)生物信息學(xué)軟件預(yù)測得到可以與UCP2結(jié)合的miRNA有miR-132-3p和miR-212-3p,在雙酶切重組質(zhì)粒和菌液PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖上可以清晰地看到出現(xiàn)目的片段,說明重組質(zhì)粒中包含有UCP2 3'-UTR目的片段;重組質(zhì)粒與miR-132-3p共轉(zhuǎn)染后檢測到mimics組的相對熒光活性顯著低于(P0.05)NC組和Blank組的相對熒光活性,直接證明miR-132-3p可以與UCP2 3'-UTR結(jié)合,說明miR-132-3p和UCP2存在靶標(biāo)關(guān)系。(3)綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中miR-132-3p和UCP2基因的表達(dá)量在細(xì)胞分化的前期和中期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。過表達(dá)miR-132-3p后,UCP2mRNA在過表達(dá)組中的表達(dá)量顯著低于(P0.05)陰性對照組,說明miR-132-3p對UCP2在mRNA水平上有負(fù)調(diào)控作用;Westernblot表明,UCP2蛋白在過表達(dá)組中的表達(dá)量顯著低于(P0.05)陰性對照組,說明miR-132-3p對UCP2在蛋白水平上也有負(fù)調(diào)控作用。
【圖文】：

２．１前體脂肪細(xì)胞的生長狀態(tài)逡逑對消化后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多只呈現(xiàn)出上皮樣細(xì)胞形態(tài)逡逑和成纖維細(xì)胞養(yǎng)形態(tài)，如圖２－ｌａ所示，６ｈ后在顯微鏡下觀察到的細(xì)胞緊貼培逡逑養(yǎng)皿底部生長，且出現(xiàn)了成梭形或者星形的細(xì)胞形態(tài)，，且有的細(xì)胞形態(tài)類似于逡逑長了兩三個觸角，初步確定本研究中培養(yǎng)的細(xì)胞為綿羊的前體脂肪細(xì)胞。圖逡逑２－ｌｂ所示為培養(yǎng)２邋ｄ后細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底部后的圖像。逡逑２４逡逑

Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｄｉｄ邋ｎｏｔ邋ｒｅｓｐｏｎｄ邋ｔｏ邋ｉｎｓｕｌｉｎ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ；邋Ｂ：邋Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋ｉｎｓｕｌｉｎ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ逡逑２．５前體脂肪細(xì)胞的分化和染色逡逑圖２－３顯示的是綿羊前體脂肪細(xì)胞不同分化時間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)。圖中的ａ，逡逑ｂ，ｃ，ｄ分別代表細(xì)胞分化了邋２ｄ，４邋ｄ，邋６邋ｄ，邋８邋ｄ�？梢灾庇^的看到，隨著綿羊逡逑前體脂肪細(xì)胞的分化天數(shù)，脂滴積少成多，且脂滴變得越來越大，填充在細(xì)胞逡逑之間。逡逑對其進(jìn)行油紅０染色，可從圖２－４看出，圖中的ａ，邋ｂ，邋ｃ，邋ｄ分別代表細(xì)逡逑胞分化了邋２ｄ，４邋ｄ，邋６邋ｄ，邋８邋ｄ。油紅０所染的紅色面積隨著誘導(dǎo)分化的天數(shù)越逡逑來越大，且區(qū)域也越來越多。這些結(jié)果表明，培養(yǎng)的細(xì)胞隨著誘導(dǎo)分化的時間逡逑延長，出現(xiàn)的脂滴越來越多，且脂滴變得越來越聚集。由２ｄ的零星脂滴分布逡逑到８ｄ的脂滴聚集，以及大量脂滴生成來看，培養(yǎng)的細(xì)胞有分化出脂滴的能力，逡逑且?guī)缀跞糠只癁槌墒斓闹炯?xì)胞。說明了本批采樣消化得到的細(xì)胞為前體脂逡逑肪細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳翠;張立敏;陳曉杰;劉喜冬;張猛;李姣;袁崢嶸;張路培;高雪;高會江;李俊雅;許尚忠;;UCP2基因遺傳多態(tài)性與西門塔爾牛生長相關(guān)性狀的遺傳效應(yīng)分析[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;2012年05期

本文編號：2687818