【摘要】：干擾素α(IFN-α)是細(xì)胞先天防御病毒侵染的第一道防線,其對(duì)各種類(lèi)型細(xì)胞的功能都有廣泛的影響。近些年來(lái),動(dòng)物IFN的研究主要集中于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,并取得了一定進(jìn)展,目前市場(chǎng)上商品化的雞、犬、豬重組IFN產(chǎn)品已應(yīng)用于實(shí)踐。然而,迄今為止,鴿IFN-α的抗病毒反應(yīng)信息以及機(jī)制特點(diǎn)還沒(méi)有被報(bào)道。在過(guò)去的幾十年里,鴿子的數(shù)量在歐洲的許多國(guó)家成指數(shù)增長(zhǎng),其密度已經(jīng)超過(guò)了 2000只/km2。由于許多病毒是在鴿子的呼吸道和胃腸道中復(fù)制,所以在集約化養(yǎng)殖中病毒更容易通過(guò)糞口或氣溶膠傳播。然而,在一定程度上由于鴿的免疫耐受性、病毒的高突變率和感染宿主的因素,疫苗對(duì)某些病毒的控制還未取得完全的成功。此外,由于禽類(lèi)養(yǎng)殖行業(yè)的病毒性疾病的問(wèn)題日益嚴(yán)重,所以人們?cè)絹?lái)越側(cè)重于對(duì)禽類(lèi)IFN-α的研究。因此,對(duì)鴿IFN-α的特征和相關(guān)信號(hào)通路的明確可以避免鴿養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益損失。在本研究中,我們克隆了 723bp鴿IFN-α的ORF區(qū),編碼240個(gè)氨基酸。與哺乳動(dòng)物IFN-α的同源性小于40%,與禽IFN-α基因的同源性在54～80%之間,其中與丹頂鶴的親緣關(guān)系最近,同源性高達(dá)79.49%。鴿IFN-α成熟肽亞克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中,在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,原核表達(dá)的鴿IFN-α成熟肽融合蛋白主要以包涵體的形式存在,大小約43KDa。重組鴿IFN-α可以抑制水泡性口炎病毒(VSV)的復(fù)制,其生物活性最高時(shí)達(dá)到5.5 × 105U/mg。此外,胰酶處理后,鴿IFN-α失去原有的抗病毒活性,然而在酸堿、低高溫處理后,其活性仍是穩(wěn)定狀態(tài)。鴿IFN-α可以通過(guò)激活STAT/Jak和PI3K-AKT-mTORC通路,以此來(lái)抑制VSV誘發(fā)的凋亡現(xiàn)象。盡管在預(yù)孵育鴿IFN-α后,p53的表達(dá)水平進(jìn)一步上升,但是雞胚成纖維細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)生凋亡。值得注意的是,雖然STAT信號(hào)通路被有效的激活,但是p53敲低后卻是抑制鴿IFN-α的抗病毒活性,減少抗病毒蛋白Mx1的表達(dá)水平,不過(guò)并沒(méi)有減弱Jak的磷酸化作用。此外p53敲低后,VSV表現(xiàn)出加劇凋亡信號(hào)通路并且誘導(dǎo)了 cleaved-Mdm2的蛋白表達(dá)。總之,p53在鴿IFN-α抗病毒過(guò)程中可能發(fā)揮一種高度互聯(lián)調(diào)節(jié)劑的作用。有趣的發(fā)現(xiàn)是在病毒侵染中,cleaved-Mdm2可能作為一個(gè)主要負(fù)調(diào)控器而綁定p53。本研究不僅豐富了鴿IFN-α抗病毒特性特點(diǎn),并且有助于解釋p53增強(qiáng)鴿IFN-α抗病毒的根本原因。通過(guò)本研究,我們首次獲得了鴿IFN-α基因,在大腸桿菌表達(dá)相應(yīng)蛋白,并證明在對(duì)VSV的抑制率強(qiáng)于雞IFN-α。此外我們從自噬和凋亡方面來(lái)探究p53在鴿干擾素α抗病毒的作用。我們實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明:(1)鴿IFN-α可以保護(hù)病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;(2)鴿IFN-α在抗病毒過(guò)程中是通過(guò)激活PI3K/AKT/mTORC通路來(lái)誘導(dǎo)自噬;(3)p53的敲低可以抑制鴿IFN-α抗病毒反應(yīng);(4)在p53被抑制表達(dá)的情況下,cleaved-Mdm2可能起到積極調(diào)解鴿IFN-α抗病毒功能的作用。
【圖文】：

ＳＴＡＴ５－ＣｒｋＬ異二聚體［２９］。為響應(yīng)ＩＦＮ的刺激，ＳＴＡＴ５與Ｔｙｋ２相互作用以及其經(jīng)過(guò)磷逡逑酸化作用，之后ＣｒｋＬ通過(guò)ＳＨ２區(qū)域綁定酪氨酸磷酸化的ＳＴＡＴ５。ＳＴＡＴ５－ＣｒｋＬ異質(zhì)二逡逑聚體復(fù)合物易位到細(xì)胞核內(nèi)以達(dá)到綁定ＧＡＳ原件（ＴＴＣＴＡＧＧＡＡ）（圖１－１所示）。逡逑ＩＦＮ邋ｓｔｇｎａＨｍｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ逡逑Ｔｙｐｅ邋Ｉ邋ＩＦＮｓ邐Ｔｙｐｅ邋ＩＩ邋ＩＦＮ邐Ｔｙｐｅ邋ＩＩＩ邋ＩＦＮａ逡逑＾邐ｆ邋ＩＦＮＧＲ－１邐ＩＬ－１０Ｆ？２邐＼逡逑．ｆｎａｒ．ｉ＿Ｉ（￡１ｆｎａｒ．２邐＼r>逡逑＾￡ｒ逡逑ｄ晰、邐抱，邐忠＝邐ａａｆ／ｇａｆ逡逑－－．．．．．—…．逡逑－［ＧＡｉｊ－ｃ＾邋￣ｎ§ｉＨ＝＾逡逑ＩＳＧ１５邐ｔＦＮ－ｔ邐ＩＲＦ－１逡逑ＩＰ－Ｗ邐ｔＲＦ－２逡逑ＩＲＦ－５邐ｉＲＦ－ｅ逡逑ＩＲＦ－７邐ＩＲＦ－９邐＆ｔｃ．逡逑ｓｔ．ｓ－ｏａｓ逡逑ＰＫＲ邋＆ｔｃ．逡逑圖Ｍ干擾素信號(hào)通路逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ逡逑１．４邋Ｉ型ＩＦＮ對(duì)病毒的控制和免疫調(diào)節(jié)逡逑１．４．１病毒侵染后的先天性免疫受體通路逡逑在病毒侵染宿主細(xì)胞時(shí)，會(huì)誘發(fā)多種細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。而Ｉ型ＩＦＮ是參逡逑與抗病毒反應(yīng)的主要的一類(lèi)因子＃邋３１］。然而先天免疫的第一步是對(duì)病原微生物的識(shí)別，，逡逑ＴＬＲ３邋可以識(shí)別雙鏈邋ＲＮＡ邋病毒，并通過(guò)邋ＴＲＩＦ邋（ＴＩＲ邋ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋ａｄａｐｔｅｒ邋ｉｎｄｕｃｉｎｇ逡逑ＩＦＮ－卩

逡逑（如圖１－３所示）。逡逑邐－？邋■■．．．．逡逑（ｐ邋＜——邐Ｍ邐■逡逑？邐＜—邋‘mP0邐＼邐＼逡逑、一、．＇，★煖逡逑Ｚ邋、邋ｒ「—邐＼逡逑ＩＦＭ邐

本文編號(hào)：2681025