【摘要】：流感病毒作為單股負(fù)鏈、分節(jié)段RNA病毒,可以通過高突變率與基因重排不斷產(chǎn)生新型病毒,給公共衛(wèi)生安全造成巨大威脅。豬作為流感病毒的中間宿主發(fā)揮“混合器”的作用,不同來源的流感病毒可以通過感染豬并在其體內(nèi)發(fā)生重排來實(shí)現(xiàn)跨物種傳播,如2009年爆發(fā)的豬源H1N1流感大流行。所以對豬流感病毒監(jiān)控與分子致病機(jī)理等的研究具有重要意義。本研究組在某發(fā)病豬場分離得到的一株歐亞類禽H1N1豬流感病毒,經(jīng)全基因組測序發(fā)現(xiàn)其PB2基因的5’端存在一新的開放閱讀框(ORF),此ORF編碼70個氨基酸,暫定名為PB2-X。為了證明該編碼區(qū)能夠穩(wěn)定表達(dá)PB2-X蛋白,我們將螢火蟲熒光素酶報告基因構(gòu)建在PB2-X ORF后面,通過Mini-genome方法來確定PB2-X的起始密碼子能否被病毒vRNPs識別轉(zhuǎn)錄并翻譯。結(jié)果顯示病毒vRNPs可以識別并表達(dá)PB2-X蛋白。隨后為了檢測PB2-X蛋白是否在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),我們將PB2-X序列克隆到帶有flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后檢測蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示PB2-X蛋白能夠在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。為了進(jìn)一步鑒定PB2-X蛋白在病毒復(fù)制過程中是否被表達(dá),我們利用合成的PB2-X多肽免疫小鼠制備成多抗,最終結(jié)果顯示在病毒復(fù)制的早期PB2-X可以被檢測到,但水平較低。為進(jìn)一步探究PB2-X蛋白功能,我們對攜帶與不攜帶PB2-X的病毒生物學(xué)特性進(jìn)行比較,由于本研究分離到的歐亞類禽H1N1豬流感病毒對小鼠沒有致病性,換以經(jīng)典H1N1豬流感病毒(CH1N1)為骨架,在不改變PB2氨基酸序列的前提下,人為引入了PB2-X,成功拯救出CH1N1-PB2-X突變病毒。通過比較原始毒株(CH1N1-WT)與含有PB2-X的突變毒株在ST與MDCK細(xì)胞上的生長曲線,發(fā)現(xiàn)CH1N1-PB2-X的復(fù)制能力強(qiáng)于CH1N1-WT,說明PB2-X有利于病毒的復(fù)制。將CH1N1-WT與CH1N1-PB2-X接種小鼠,結(jié)果CH1N1-WT對小鼠的致病性顯著強(qiáng)于CH1N1-PB2-X,說明PB2-X的存在對病毒在小鼠上的致病性起到致弱作用。為了進(jìn)一步研究PB2-X影響病毒復(fù)制與致病性的分子機(jī)制,我們檢測了PB2-X對H1N1病毒聚合酶活性的影響。利用Mini-genome方法檢測發(fā)現(xiàn),過表達(dá)PB2-X蛋白可以抑制聚合酶活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PB2-X影響聚合酶活性的原因是其過表達(dá)后抑制了Mini-genome中聚合酶蛋白(如PB2,NP)真核表達(dá)質(zhì)粒的蛋白表達(dá)造成的,而這些蛋白都是利用CMV啟動子驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的,對PB2基因的mRNA檢測結(jié)果顯示,PB2-X對PB2基因的mRNA水平影響不明顯,此結(jié)果顯示PB2-X蛋白可能具有抑制宿主mRNA的翻譯過程。為了進(jìn)一步驗證這種抑制作用是否具有廣譜性,我們將PB2-X真核表達(dá)質(zhì)�；蛘呖蛰d體質(zhì)粒分別與含有CMV啟動子的EGFP表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PB2-X蛋白可以抑制EGFP蛋白的表達(dá),說明PB2-X具有抑制宿主蛋白翻譯系統(tǒng)的功能。本研究對一株歐亞類禽H1N1豬流感病毒上發(fā)現(xiàn)的新型PB2-X蛋白進(jìn)行鑒定與其功能的初步研究,為進(jìn)一步研究歐亞類禽豬流感病毒致病機(jī)理與防控提供參考。
【圖文】：

圖 1.1 流感病毒結(jié)構(gòu)圖 (Vaccines 2015, 3(2), 373-389)Figure 1.1 Structure of the influenza virus染宿主過程主第一步就是 HA 蛋白與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)

圖 1.2 流感病毒生活史(von Itzstein, 2007)Figure 1.2 Life cycle of the influenza virus1.3 流感病毒編碼蛋白與功能1.3.1 流感病毒編碼主要蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2680729