【摘要】：熱應(yīng)激是影響南方地區(qū)綿羊生產(chǎn)的重要因素,解析熱應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制、選育耐熱品種對(duì)于減少熱應(yīng)激給綿羊養(yǎng)殖造成的經(jīng)濟(jì)損失具有重要的意義。湖羊是江蘇省特色綿羊品種,具有產(chǎn)羔多、性成熟早、耐濕熱等特點(diǎn)。烏骨綿羊原產(chǎn)于云南南坪,對(duì)熱應(yīng)激敏感。課題前期工作中,對(duì)熱應(yīng)激敏感組和抗性組湖羊下丘腦進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)D氨基酸氧化酶基因(DAO)表達(dá)差異顯著。本論文在此基礎(chǔ)上,克隆DAO基因、分析組織表達(dá)譜及腎臟中表達(dá)定位;研究熱應(yīng)激敏感組和抗性組湖羊腎組織中DAO的表達(dá)、氧化應(yīng)激、凋亡的差異;篩選DAO基因在湖羊和烏骨綿羊群體中的SNPs位點(diǎn),并通過(guò)基因轉(zhuǎn)染,探討DAO基因及其突變對(duì)腎細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響,以期為解析綿羊熱應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制提供線索,為熱應(yīng)激品種選育提供候選的分子標(biāo)記。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)DAO基因克隆、生物特征及組織表達(dá)譜分析:通過(guò)PCR擴(kuò)增,克隆出湖羊D4O基因編碼區(qū)全序列,長(zhǎng)度為1044bp,編碼347個(gè)氨基酸殘基。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物DAO種屬差異不大,比較保守;湖羊DAO蛋白分子量39238Da,不存在信號(hào)肽,等電點(diǎn)6.82,消光系數(shù)78755,為親水性蛋白;含有3個(gè)絲氨酸、9個(gè)蘇氨酸、2個(gè)酪氨酸共14個(gè)磷酸化位點(diǎn);含有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)O-糖基化位點(diǎn);DAO蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由54.2%的氨基酸無(wú)規(guī)則卷曲、27.4%的氨基酸α螺旋和18.4%的氨基酸β折疊組成。DAO基因具有組織表達(dá)特異性,在湖羊腎臟中表達(dá)最高,其次為肝臟、下丘腦。免疫組化發(fā)現(xiàn)DAO在腎小管的近端小管、遠(yuǎn)端小管和細(xì)段中高表達(dá),而在腎小體中不表達(dá)。(2)腎組織DAO表達(dá)及其氧化損傷與熱應(yīng)激敏感性的關(guān)聯(lián):以24h為周期連續(xù)240h監(jiān)測(cè)高溫季節(jié)湖羊直腸溫度變化,篩選出熱應(yīng)激敏感、抗性湖羊各5只,適宜環(huán)境飼養(yǎng)10天后,42℃急性熱應(yīng)激4h,選擇直腸溫度變化最大的3只作為熱應(yīng)激敏感組,直腸溫度變化最小的3只作為熱應(yīng)激抗性組,采集綿羊腎組織,測(cè)定DAO表達(dá)及氧化損傷,發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激敏感組DAO mRNA表達(dá)和H2O2含量均顯著高于抗性組(p0.05),也顯著高于未熱應(yīng)激對(duì)照組(p0.05);熱應(yīng)激敏感組DAO蛋白表達(dá)、Caspase 3活性均顯著高于抗性組(p0.05),也極顯著高于未熱應(yīng)激對(duì)照組(p0.01);熱應(yīng)激敏感組Bax/Bcl-2mRNA表達(dá)極顯著高于抗性組(p0.01),也極顯著高于未熱應(yīng)激對(duì)照組(p0.01)。這些結(jié)果提示熱應(yīng)激可能通過(guò)上調(diào)DAO表達(dá),導(dǎo)致腎組織氧化損傷和凋亡,湖羊熱應(yīng)激抗性可能與DAO低表達(dá),氧化損傷和凋亡較少有關(guān)。(3)過(guò)表達(dá)DAO對(duì)腎細(xì)胞熱應(yīng)激損傷的影響:構(gòu)建DAO真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-DAO,以pcDNA3.1(+)為對(duì)照載體,轉(zhuǎn)染腎細(xì)胞,熱應(yīng)激處理,發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞ROS增加,Hsp70表達(dá)上升,過(guò)表達(dá)DAO組ROS和Bax/Bcl-2mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(p0.05),Hsp70mRNA表達(dá)極顯著高于對(duì)照組(p0.01),提示過(guò)表達(dá)DAO通過(guò)增加氧化損傷和凋亡加劇了熱應(yīng)激損傷。(4)綿羊DAO突變位點(diǎn)對(duì)腎細(xì)胞熱應(yīng)激損傷的影響:以耐濕熱的湖羊群體和不耐熱的烏骨綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象,篩選DAO基因在兩綿羊群體中單核苷酸多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)640位點(diǎn)在湖羊和烏骨綿羊群體間基因型頻率差異顯著,湖羊以GG型為主,烏骨綿羊以AA型為主。構(gòu)建 AA 型、GG 型過(guò)表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)-DAO-AA 和 pcDNA3.1(+)-DAO-GG,轉(zhuǎn)染腎細(xì)胞系,熱應(yīng)激處理,發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激下腎細(xì)胞ROS增加,轉(zhuǎn)染AA型載體的腎細(xì)胞ROS顯著高于GG型,熱應(yīng)激處理腎細(xì)胞Hsp70和Bax/Bcl-2mRNA表達(dá)上升,轉(zhuǎn)染AA型載體Hsp70和Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)高于GG型(p0.01),提示DAO基因640位點(diǎn)GG型綿羊?qū)釕?yīng)激耐受性更好。
【圖文】：

茨海默病、脊髓側(cè)索硬化等神經(jīng)或精神疾病有密切關(guān)系，其可能參與這些疾病的發(fā)生、展過(guò)程，而作用機(jī)制與Ｄ－絲氨酸過(guò)度激活ＮＭＤＡ受體或者ＮＭＤＡ受體功能低下。研表明，Ｄ氨基酸氧化酶（ＤＡＯ）是消除Ｄ－絲氨酸的主要機(jī)制，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫誘氧化應(yīng)激。伴隨活性氧（ＲＯＳ）產(chǎn)生增加，脂質(zhì)過(guò)氧化或抗氧化防御系統(tǒng)的失活。氧化激被認(rèn)為是導(dǎo)致動(dòng)物熱應(yīng)激免疫反應(yīng)受損的關(guān)鍵因素之一。逡逑２邋Ｄ氨基酸氧化酶逡逑２．１邋Ｄ氨基酸氧化酶生化特性逡逑Ｄ氧基酸氧化酶（Ｄ－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｉｄ邋Ｏｘｉｄａｓｅ，ＤＡＯ，ＤＡＡＯ）是一種黃素腺嘿呤二核酸（ＦＡＤ）依賴(lài)性酶，催化Ｄ－氨基酸的氧化脫氨基，產(chǎn)生相應(yīng)的ａ－酮酸、過(guò)氧化氫和氨ＤＡＯ催化的反應(yīng)可分為：（１）還原性半反應(yīng)，其中ＤＡＯ催化Ｄ－氨基酸脫氫為其亞氨對(duì)應(yīng)物，同時(shí)將ＦＡＤ還原為ＦＡＤＨ２。（２）氧化半反應(yīng)，其中ＦＡＤＨ２被分子氧（生理子受體）再氧化以產(chǎn)生過(guò)氧化氫（圖１－１中的反應(yīng)２ａ）邋；邋ＦＡＤＨ２＆可以通過(guò)人工電子體體外再氧化，例如一些氧化還原染料（圖１－１中的反應(yīng)２ｂ）。（３）亞氨基酸的自發(fā)解反應(yīng)，得到ａ－酮酸和氨［５＿。逡逑

解毒酶如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶或過(guò)氧化氫酶保護(hù)細(xì)胞免受自由基誘導(dǎo)的損傷，但是過(guò)量的逡逑ＲＯＳ產(chǎn)生和抗氧化防御的破壞或消耗導(dǎo)致氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激逡逑最終會(huì)造成細(xì)胞損傷（圖１－２）。逡逑Ｄ－ＡＡＣＶＦＡＯＨ，邋？邋Ｏ，邋Ｄ－ＡＡＯＦＡＤ邋＊邋Ｈ，０，逡逑？邐２邋Ｈ？０邋？邋Ｏｊ逡逑Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ邋ｄｔｓｍｕｔａｓｅ邐＼逡逑ｈ丨。，，挪。心１0逡逑２邋０，＊？邋？邋２邋Ｈ＊邐／邐ＧＳＨ邋ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ逡逑＼邋ｆ邋逡逑圖１－２邐產(chǎn)生過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞損傷逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｐｅｒｏｘｉｄｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｆｒｏｍ邋ＤＡＯ邋ｐｒｏｄｕｃｅ邋ｃｅｌｌ邋ｄａｍａｇｅ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S826

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本文編號(hào)：2674003