【摘要】：微衛(wèi)星是分析種群遺傳多樣性、鑒別親子關(guān)系最主要的DNA分子標(biāo)記。驢的品種種類繁多,利用微衛(wèi)星研究驢群的遺傳多樣性、確定子代與父本間的親緣關(guān)系,可以幫助我們對其進行遺傳資源保護或人工選育。在以往的研究中,人們利用馬的微衛(wèi)星熒光多重PCR體系研究驢的群體結(jié)構(gòu)或鑒定驢的親緣關(guān)系,由于用于鑒定的微衛(wèi)星位點不合適、引物特異性差以及擴增效率低,常存在基因分型困難的問題。2017年,國際動物遺傳學(xué)協(xié)會(ISAG)推薦13個雙核苷酸微衛(wèi)星位點(AHT4、ASB23、HMS2、HMS3、HMS6、HMS7、HMS18、HTG7、HTG10、TKY297、TKY312、TKY337和TKY343),用于驢的個體識別和親子鑒定研究。到目前為止,還沒有研究構(gòu)建出一組包含這13個核心位點的多重PCR體系。本研究通過重新設(shè)計部分微衛(wèi)星位點的引物、反復(fù)試驗優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,構(gòu)建一組驢的微衛(wèi)星13重PCR體系,包含ISAG推薦的13個微衛(wèi)星位點。(1)本研究使用低成本的擴增酶可以高效地在一個PCR反應(yīng)中擴增全部的微衛(wèi)星位點,優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系縮減為15μL、PCR反應(yīng)時間縮短為73 min。熒光標(biāo)記引物的應(yīng)用使擴增產(chǎn)物的測序變得快速、簡單。(2)本研究檢測了該多重PCR體系的靈敏度,僅使用5 ng的驢樣本DNA為模板,便可獲得完整準(zhǔn)確的基因分型圖譜。(3)通過檢測該多重PCR體系的物種特異性,發(fā)現(xiàn)以13個物種的基因組DNA為模板無法得到完整的基因分型圖譜。(4)本研究提供了首個驢的等位基因分型表和Stutter分析結(jié)果,有助于研究人員揭示準(zhǔn)確的基因型。(5)以150頭驢為樣本,計算群體統(tǒng)計學(xué)參數(shù),分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)位點的雜合度與多態(tài)信息含量很高,該多重PCR體系的CPE_(trio)可達到0.999665018,表明該多重PCR體系具有研究驢的遺傳多樣性及鑒定親子關(guān)系的能力。試驗結(jié)果表明,本研究開發(fā)的微衛(wèi)星13重PCR體系,是一種快速、高效、靈敏度高、物種特異性好、準(zhǔn)確可靠的檢測手段,適用于驢的群體遺傳分析、個體識別以及親子鑒定,同時具有法醫(yī)應(yīng)用潛力。
【圖文】：

檢測新設(shè)計引物的特異性，確保 PCR 擴增產(chǎn)物條帶單一明亮。預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，Tm ±3 ℃ 30 s，72 ℃延伸 30 s，5 min。 13 重 PCR 體系的構(gòu)建與優(yōu)化星 13 重 PCR 體系的構(gòu)建用 AHT4、ASB23、HMS2、HMS3 和 HMS6 位點的引物構(gòu)建 5 重初始濃度和 PCR 反應(yīng)條件參考 Shang 等（2018）的研究報告。 PCR 體系的引物濃度和退火溫度，，以產(chǎn)物的目的條帶清晰且擴使用 4 %的瓊脂糖凝膠電泳對擴增結(jié)果進行檢測。接著在 5 重 PC位點的引物，利用多重PCR擴增方法和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果對體 重 PCR 體系。以此類推，不斷加入新的引物并通過反復(fù)試驗進出 13 重 PCR 體系。微衛(wèi)星 13 重 PCR 體系的構(gòu)建方法如圖 2-1

模板進行擴增，不同物種的 DNA 樣本加入量為 30-50 ng。使用 產(chǎn)物送至上海生工測序部進行 CE 測序。析聚合酶滑脫產(chǎn)物分析 PCR 擴增微衛(wèi)星位點序列時，往往會在 DNA 復(fù)制的過程中發(fā)生 聚合酶滑脫產(chǎn)物（Stutter）的產(chǎn)生，這在分析雙核苷酸微衛(wèi)星的Shang et al.，2018）。在 PCR 擴增過程中，當(dāng)堿基發(fā)生正向滑脫產(chǎn)物少一個重復(fù)單位的 PCR 產(chǎn)物（minus Stutter），當(dāng)堿基發(fā)生要擴增產(chǎn)物多一個重復(fù)單位的 PCR 產(chǎn)物（plus Stutter），如圖 us Stutter 的峰值占主要擴增產(chǎn)物峰值的比值和 plus Stutter 的峰值比值，可以指導(dǎo)實驗人員選擇正確的基因型（Shang et al.，2018
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S822

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本文編號：2670474