【摘要】：樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞(Antigen presenting cell,APC),也是目前發(fā)現(xiàn)唯一能直接激活初始型T細(xì)胞的APC。DCs廣泛存在于胃腸道中,是腸道黏膜免疫系統(tǒng)主要的守衛(wèi)者,在調(diào)節(jié)黏膜免疫應(yīng)答及免疫耐受中扮演著重要角色。近年來研究發(fā)現(xiàn),多種微生物能影響DCs的分化和成熟,包括腸道乳酸菌。乳酸菌具有免疫調(diào)節(jié)作用,可以調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞如DCs和NK,促進(jìn)其生長和發(fā)育。本研究以雞腸道約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii,L.johnsonii)為研究對(duì)象,研究其對(duì)雞骨髓源樹突狀細(xì)胞(Chicken bone marrow-derived dendritic cells,ChBM-DCs)的影響。主要從DCs的形態(tài)、細(xì)胞表面分子表達(dá)情況、吞噬能力、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed lymphocyte reaction,MLR),Toll樣受體(Toll-like receptor,TLRs)、MyD88/NF-κB信號(hào)通路分子和細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:為獲得chBM-DCs,我們選取4-6周齡SPF雞,取其股骨和脛骨,利用Histopaque-1119淋巴細(xì)胞分離液分離得到雞骨髓源單核細(xì)胞,平鋪6孔板,加入rcGM-CSF和rcIL-4細(xì)胞因子,置于39℃、5%CO_2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d時(shí),經(jīng)倒置顯微鏡觀察可看見大量細(xì)胞集落形成,培養(yǎng)至6 d時(shí),細(xì)胞集落松散貼壁,獲得了未成熟的chBM-DCs。將培養(yǎng)至6d的細(xì)胞分成3組:陰性對(duì)照組,加入相等量的基礎(chǔ)RPMI-1640;陽性對(duì)照組,加入終質(zhì)量濃度為200 ng/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS);試驗(yàn)組,加入經(jīng)紫外滅活濃度為100μg/mL的L.johnsonii,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示:通過流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)1 d和7 d的雞骨髓源單核細(xì)胞細(xì)胞表面分子表達(dá),結(jié)果顯示:第1 d時(shí),細(xì)胞表面不表達(dá)CD11c和MHC-II分子;第7 d,未刺激組、LPS刺激組和L.johnsonii刺激組細(xì)胞表面高表達(dá)CD11c,純度達(dá)70%以上;未刺激組chBM-DCs低表達(dá)CD40和CD86,細(xì)胞處于未成熟狀態(tài),而LPS刺激組和L.johnsonii刺激組,CD40和CD86表達(dá)量上調(diào),細(xì)胞被刺激成熟。經(jīng)RT-qPCR檢測chBM-DCs中CD80、CD86和DEC-205 mRNA轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與未刺激組相比,LPS刺激組和L.johnsonii刺激組CD80、CD83和DEC-205的mRNA表達(dá)量上調(diào),其中CD83的mRNA水平差異極顯著(P0.01)。收集誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d、4 d、6 d和7 d未經(jīng)刺激的細(xì)胞以及經(jīng)LPS和L.johnsonii刺激24 h的chBM-DCs,采用中性紅檢測其吞噬能力,結(jié)果顯示,雞骨髓單核細(xì)胞經(jīng)rcGM-CSF和rcIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d、4 d、6 d和7 d后,吞噬能力先增強(qiáng)后降低,第6 d時(shí)吞噬能力達(dá)到最大;與未刺激的chBM-DCs相比,經(jīng)LPS和L.johnsonii刺激的chBM-DCs吞噬能力降低,但差異不顯著(P0.05)。以未成熟的chBM-DCs以及經(jīng)LPS(200 ng/mL)和L.johnsonii(100μg/mL)刺激成熟的chBM-DCs為刺激細(xì)胞,同種異體T淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞,分別按刺激細(xì)胞:反應(yīng)細(xì)胞為1:1、1:10、1:100的比例進(jìn)行混合,采用CCK-8試劑盒檢測T細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示,經(jīng)LPS和L.johnsonii刺激成熟的chBM-DCs均能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖,與對(duì)照組相比差異極顯著(P0.01),刺激指數(shù)隨著細(xì)胞數(shù)的減少而降低。采用LPS和L.johnsonii刺激chBM-DCs,分別于刺激后6 h、12 h和24 h收集細(xì)胞,以未經(jīng)刺激的chBM-DCs作為對(duì)照,通過RT-qPCR方法檢測TLR2/4/5/15和MyD88/NF-κB信號(hào)通路分子等mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,以觀察不同刺激時(shí)間L.johnsonii對(duì)chBM-DCs的影響。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,L.johnsonii在各時(shí)間段都能夠促進(jìn)TLR2、TLR4和TLR5 mRNA表達(dá)量增加(fold change1),特別是TLR5,而TLR15 mRNA的表達(dá)量下降(fold change1);與LPS組相比,TLR2在L.johnsonii刺激6 h和12 h后mRNA的表達(dá)量分別差異極顯著(P0.01)和差異顯著(P0.05),TLR4在L.johnsonii刺激6 h后mRNA的表達(dá)量差異顯著(P0.05),而TLR5在各時(shí)間段mRNA的表達(dá)量均差異極顯著(P0.01)。在LPS組和L.johnsonii組,TLR15的mRNA表達(dá)量均低于未刺激組(fold change1)。同時(shí),L.johnsonii在各時(shí)間段都能夠促進(jìn)MyD88/NF-κB信號(hào)通路mRNA表達(dá)量增加(fold change1)。采用不同濃度的L.johnsonii(1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL)刺激chBM-DCs,于刺激后6 h、12 h和24 h收集細(xì)胞,通過RT-qPCR方法檢測Th1型和Th2細(xì)胞因子、促炎性細(xì)胞因子和趨化因子基因的轉(zhuǎn)錄水平,以分析L.johnsonii不同濃度和不同刺激時(shí)間對(duì)上述細(xì)胞因子的影響。結(jié)果顯示,與未刺激組相比,在各個(gè)時(shí)間段低濃度L.johnsonii(1μg/mL)刺激的chBM-DCs細(xì)胞因子和趨化因子(CXCLi1)mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低(fold change1);中高濃度的L.johnsonii(10μg/mL和100μg/mL)刺激chBM-DCs后,在各個(gè)時(shí)間段Th1型細(xì)胞因子、促炎性細(xì)胞因子和趨化因子mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于未刺激組(fold change1),而僅高濃度L.johnsonii(100μg/mL)組才能夠促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量增加(fold change1),LPS組在各個(gè)時(shí)間段均不能促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子(IL-4)mRNA相對(duì)表達(dá)量增加(fold change1)。高濃度L.johnsonii組在各個(gè)時(shí)間段IL-12、IFN-γ、IL-1β和IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于LPS組(P0.01)。此外,Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α)以及促炎性細(xì)胞因子和趨化因子mRNA的表達(dá)量隨著刺激時(shí)間的增加而降低,而Th2型細(xì)胞因子隨著刺激時(shí)間的增加而增加。以上結(jié)果表明,L.johnsonii能夠刺激chBM-DCs成熟,并且以劑量依懶性和時(shí)間依賴性方式影響chBM-DCs細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生,同時(shí)可以調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡,維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。
【圖文】：

表達(dá)是誘導(dǎo) DCs 分化成熟的基礎(chǔ)，影響著其功能的發(fā)揮[44]。TLRs間的關(guān)系己成為免疫學(xué)等研究疾病發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)[45]。TLRs 是一類，其胞外有亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)可以識(shí)別病原微生物。 現(xiàn) ， 不 同 的 TLRs 活 化 后 的 信 號(hào) 通 路 也 不 相 同 。 髓 樣ifferentiationfactor88，MyD88）、TRIF 以及 TRIF 相關(guān)的接頭分子是白分子[46]，其中 MyD88 是 TLRs 在胞漿內(nèi)重要的接頭蛋白分子，主要 依賴途徑和非 MyD88 依賴途徑[47]。其中大多數(shù) TLRs 的信號(hào)傳導(dǎo)途這種途徑與成熟 DCs 釋放炎癥細(xì)胞因子有關(guān)。DCs 表面的 TLRs 可以二者結(jié)合后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，隨后再與 MyD88 結(jié)合，又導(dǎo)致其本身發(fā)離，將信號(hào)傳遞給下游分子，，經(jīng)過一系列蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)，最終46]。NF-κB 信號(hào)通路的激活上調(diào)了 DCs 表面共刺激分子和 MHC-II 的放大量的細(xì)胞因子，激活初始型 T 淋巴細(xì)胞，促進(jìn) T 細(xì)胞增殖分化，-Nhoum 等已證實(shí) TLRs 可以與腸道內(nèi)的益生菌的 MAMP 發(fā)生特異性 信號(hào)通路來維持腸道穩(wěn)態(tài)[48]。Galdeano 等研究表明，乳酸桿菌的微icrobe asso-dated molecular patterns，MAMP）通過與 DCs 表面的 T NF-κB 信號(hào)途徑刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子，啟動(dòng)天然免疫和獲

圖 1-2 益生乳酸菌與樹突狀細(xì)胞的相互作用[62]Fig. 1-2 Interaction of the probiotic lactobacillus with dendritic cells因子在免疫過程中的作用子（Cytokine）是一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，主要是疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成分泌的，可廣泛調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答和造血功能，過程。細(xì)胞因子種類繁多，功能十分復(fù)雜，按照生物學(xué)功能分類主要刺激因子、干擾素、腫瘤壞死因子、趨化性因子以及生長因子等。細(xì)個(gè)階段都起著十分重要的作用，被認(rèn)為是免疫反應(yīng)中的決定性因子，的活化、增殖與分化，決定其分化的方向[65, 66]。初始 T 細(xì)胞被抗原激Th0 細(xì)胞可化為 Th1 和 Th2 細(xì)胞，局部微環(huán)境中的細(xì)胞因子種類是決因素。IL-12 可促進(jìn) Th1 細(xì)胞的分化，IL-4 可促進(jìn) Th2 細(xì)胞的分化生不同的細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。Th1 細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)，同時(shí)也能夠激活固有免疫應(yīng)答；Th2 細(xì)胞可細(xì)胞因子，參與抗病蟲感染，促進(jìn) B 細(xì)胞的活化、增殖與分化。Th1 細(xì)胞疫應(yīng)答，并且抑制 Th2 細(xì)胞功能；Th2 細(xì)胞分泌 IL-10，抑制 Th1 細(xì)
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S831

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2669706