【摘要】：奶牛乳腺炎通常由致病菌侵入奶牛乳腺后并在乳房增殖引起的一種疾病,是奶牛養(yǎng)殖業(yè)最流行的疾病之一,給全球造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而環(huán)境中的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌被認(rèn)為是奶牛乳腺炎的主要致病菌。大腸桿菌的主要結(jié)構(gòu)元件脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和金黃色葡萄球菌胞壁成分脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)可通過結(jié)合Toll樣受體引起NF-κB轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的激活參與炎癥反應(yīng)過程。越來越多的研究表明長(zhǎng)非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)也在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,然而參與牛乳腺炎中l(wèi)ncRNA及其功能仍然未知。本實(shí)驗(yàn)中使用熱滅活的細(xì)菌處理奶牛乳腺上皮細(xì)MAC-T細(xì)胞,以腫瘤壞死因子-α明顯上調(diào)作為炎性應(yīng)答指標(biāo),建立乳腺炎細(xì)胞模型,并通過高通量測(cè)序分析獲得了正常MAC-T細(xì)胞和乳腺炎模型細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜,然后運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選出差異表達(dá)的lncRNA,最后結(jié)合CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步研究特定候選lncRNA的功能。測(cè)序結(jié)果中共鑒定出1323個(gè)新的lncRNA,其中53個(gè)為差異表達(dá)的lncRNA。而lncRNA的功能預(yù)測(cè)表明差異表達(dá)的lncRNA與細(xì)胞免疫密切相關(guān)。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的被命名為lncRNA-TUB的lncRNA進(jìn)行深入功能研究發(fā)現(xiàn),敲除lncRNA-TUB后,乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生了明顯的EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)現(xiàn)象,同時(shí)影響上皮細(xì)胞增殖、遷移、酪蛋白分泌等生理過程,并參與乳腺上皮細(xì)胞的炎癥應(yīng)答過程。綜上所述,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究篩選出的差異表達(dá)的lncRNA與奶牛乳腺炎緊密相關(guān),而lncRNA-TUB在包括炎癥應(yīng)答在內(nèi)的很多重要的生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究初步探索了lncRNAs與奶牛乳腺炎之間的相互聯(lián)系,為奶牛乳腺炎的病理機(jī)制的研究提供了新的思路。
【圖文】：

圖 1 六個(gè)文庫(kù)中序列的參考基因組比對(duì)率Fig. 1 The number of filtered reads obtained in each biological replicates of Con, EC andSA samples and the percentage of aligned sequences to the bovine reference genome. The blueand the pink color represent the percentage of unmapped and mapped sequence reads respectively.Rep-1 and Rep-2 are the biological replicates in each sample.2.5.2 鑒定預(yù)測(cè)的 lncRNA為了減少假陽(yáng)性 lncRNA 和假陰性 lncRNA 結(jié)果出現(xiàn)的可能性，我們建立了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選流程（圖 2）。作為 lncRNA 鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 使用 CPC 和 CNCI 軟件同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行編碼潛力分析。CPC 鑒定出 1448 個(gè)預(yù)測(cè)的非編碼轉(zhuǎn)錄本，CNCI 鑒定出 2588 個(gè)預(yù)測(cè)的非編碼轉(zhuǎn)錄本。取兩個(gè)軟件鑒定出的共同的序列集（包含 1323 個(gè)非編碼序列）作為預(yù)測(cè)的 lncRNA。所有鑒定出的 lncRNAs 通過Cufflinks 區(qū)分為 5 類：基因間 lncRNA，內(nèi)含子 lncRNA，反義 lncRNA，正義 lncRNA和雙向 lncRNA。

這些實(shí)驗(yàn)組中上調(diào)的 mRNA 數(shù)量也多過下調(diào)的 mRNA 數(shù)量（圖3）。更值得注意的是，差異表達(dá)的 mRNA 和 lncRNA 的聚類分析顯示金黃色葡萄球菌處理組與對(duì)照組聚為了一類，而大腸桿菌處理組卻反而沒能與金黃色葡萄球菌處理組聚類(圖 4)。另外，還發(fā)現(xiàn)一些差異表達(dá)的 lncRNA 和 mRNA 在其他實(shí)驗(yàn)組中也有表達(dá)。這些證據(jù)表明，差異表達(dá)的 lncRNAs 可能為細(xì)菌特異性乳腺炎導(dǎo)致不同臨床癥狀的表觀遺傳學(xué)原因。圖 3 差異表達(dá)的 mRNA 和 lncRNA 的比較(A)和(B)分別為表達(dá)上調(diào)下調(diào)的 mRNA 和 lncRNA 的數(shù)目。(C)和(D)分別為差異表達(dá)的 mRNA 和 lncRNA 在 CON vs EC 組，CON vs SA 和 EC vsSA 組中的分布。Fig.3 Comparison of differentially expressed lncRNA and mRNA. (A) and (B) Numbers ofup-regulated and down-regulated mRNAs and lncRNAs were calculated in CON vs EC group,CON vs SA group and EC vs SA group. (C) and (D) Venn diagram showed the differentiallyexpressed mRNAs and lncRNAs in CON vs EC group, CON vs SA group
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.23

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4 王春t，

本文編號(hào)：2669355