【摘要】：肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN)是一種生長因子,屬于TGF-β超家族,主要在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá),對肌肉的生長具有負(fù)調(diào)控作用。MSTN基因的過表達(dá)可引起肌肉萎縮,而MSTN基因發(fā)生突變或被敲除時則會使動物的肌肉量增加,產(chǎn)生雙肌現(xiàn)象。本研究利用克隆獲得的綿羊MSTN基因構(gòu)建真核表達(dá)載體,同時設(shè)計合成MSTN干涉序列并構(gòu)建RNA干涉載體,共轉(zhuǎn)染293GP細(xì)胞后經(jīng)熒光定量PCR檢測獲得干涉效率最佳的載體;將其線性化后轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞后,經(jīng)G418篩選獲得MSTN敲低轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系;以MSTN敲低轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核供體,利用細(xì)胞核移植的方法獲得MSTN敲低轉(zhuǎn)基因綿羊克隆胚和轉(zhuǎn)基因綿羊,以期建立獲得肌肉豐滿綿羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),獲得了基因編輯胚胎和小鼠,為后續(xù)利用CRIISPR/Cas9系統(tǒng)獲得基因打靶綿羊奠定基礎(chǔ)。本研究的結(jié)果與結(jié)論如下:1、綿羊MSTN基因RNA干涉載體構(gòu)建和活性分析(1)綿羊Myostatin基因的克隆:參照GenBank中綿羊MSTN基因序列(AF019622.1),采用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù),克隆綿羊肌肉生長抑制素基因,將其連接到pcDNA3.1(+)載體,獲得肌肉抑制素基因真核表達(dá)載體;(2)RNA干涉表達(dá)載體的構(gòu)建:參照綿羊MSTN基因的mRNA序列,設(shè)計合成RNA干涉序列并與pRNAT-U6載體連接,獲得RNA干涉表達(dá)載體。與真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293GP細(xì)胞后,通過實時定量PCR檢測干涉效率,獲得干涉效果最佳序列。(3)RNA干涉載體表達(dá)活性檢測:將篩選獲得的RNA干涉載體線性化,采用顯微注射的方式,注射到小鼠原核時期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂為2細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)最終獲得表達(dá)綠色熒光蛋白的囊胚,表明所構(gòu)建的RNA干涉載體可以在胚胎中正常表達(dá)并支持胚胎的發(fā)育。2、綿羊MSTN敲低轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞系的建立通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將線性化的RNA干涉載體轉(zhuǎn)染到綿羊成纖維細(xì)胞中,經(jīng)G418篩選,獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞;PCR結(jié)果顯示,構(gòu)建的基因已整合到細(xì)胞基因組中;對獲得的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、生長曲線以及冷凍復(fù)蘇后特征的檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因細(xì)胞具有正常細(xì)胞的生物學(xué)特征。3、綿羊MSTN敲低轉(zhuǎn)基因胚胎的獲得(1)供體細(xì)胞的修飾和處理:來源于成纖維細(xì)胞的核移植胚胎的卵裂率為44.6%,高于MSTN敲低轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的33.0%,且差異顯著,但兩者的桑/囊胚率差異不顯著(分別為24.1%和15.6%);供體細(xì)胞不需進(jìn)行血清饑餓處理,使用接觸抑制方法可以達(dá)到相同效果。(2)重構(gòu)胚的融合、激活和培養(yǎng):采用逐個融合(一次一個)的融合方式能顯著提高融合效率,但融合后的胚胎發(fā)育能力和批量融合(一次多個)方法比差異不顯著;采用A23187+6-DMAP激活卵母細(xì)胞與采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之間的效果差異不大;重構(gòu)胚融合后培養(yǎng)34 h后再進(jìn)行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚發(fā)育率。KSOM和SOFaa都可以用來進(jìn)行綿羊克隆胚的體外培養(yǎng)。4、轉(zhuǎn)基因核移植胚胎的移植和胎兒鑒定(1)重構(gòu)胚的移植:采用輸卵管移植方法,將原核期或2-細(xì)胞期的核移植胚胎(242枚)移植到同步發(fā)情的受體綿羊(23只)體內(nèi),以檢驗其在體內(nèi)的發(fā)育能力。(2)轉(zhuǎn)基因胎兒鑒定:在23只受體中,最終只有1只受體妊娠,但妊娠期間發(fā)生流產(chǎn),未能獲得成活個體,獲得流產(chǎn)胎兒1只;對流產(chǎn)胎兒進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果顯示,胎兒基因組中整合有目的基因。5、肌肉特異表達(dá)Cas9蛋白打靶胚胎的獲得(1)Rosa26基因sgRNA的設(shè)計和體外驗證:根據(jù)小鼠Rosa26基因序列設(shè)計sgRNA,體外編輯試驗表明,所設(shè)計的sgRNA可以對Rosa26位點發(fā)生編輯作用;(2)肌肉特異打靶載體的構(gòu)建:通過PCR和同源重組連接,成功構(gòu)建了肌肉特異表達(dá)Cas9蛋白的同源打靶載體Donor-SP-Cas9-DsRed;(3)Rosa26基因編輯胚胎和小鼠的獲得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚發(fā)育,通過PCR和測序結(jié)果顯示,獲得的胚胎為基因編輯胚胎,注射的胚胎經(jīng)胚胎移植后,獲得了 Rosa26基因編輯小鼠;(4)通過將同源打靶載體與Rosa26 sgRNA和Cas9聯(lián)合注射的方式,獲得肌肉特異表達(dá)Cas9蛋白的基因打靶胚胎;綜上所述,通過構(gòu)建MSTN基因RNA干涉載體、轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞建立MSTN敲低轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核移植等程序,可以獲得MSTN敲低的綿羊轉(zhuǎn)基因克隆胚,胚胎移植后獲得流產(chǎn)胎兒且攜帶外源基因,表明獲得的重構(gòu)胚具有體內(nèi)發(fā)育能力,可以通過該方法獲得MSTN敲低的轉(zhuǎn)基因綿羊。本研究結(jié)果為培育MSTN敲低的綿羊新品系提供了依據(jù)。此外,通過利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),獲得了基因編輯胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因編輯和基因打靶體系,為后續(xù)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得基因打靶綿羊奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

Ｃ：邋Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｐｉｐｅｔｔｅ邋ｉｎｊｅｃｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ邋（２０0ｘ）；邋Ｄ：邋Ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ邋ｖｏｌｕｍｅ邋ｅｘｐａｎｓｉｏｎ邋（２０0ｘ）；逡逑Ｅ：邋Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｐｉｐｅｔｔｅ邋ｐｕｌｌｅｄ邋ｏｕｔ邋（２００ｘ）；邋Ｆ：邋Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ邋（１０0ｘ）；逡逑圖２￣４小鼠原核期胚胎的顯微注射過程逡逑Ｆｉｇ．邋２－４邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ－ｓｔａｇｅ邋ｍｏｕｓｅ邋ｅｍｂｒｙｏｓ邋ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ逡逑；：：ｉ~栧義希穡媯澹椋┘殄義賢跡玻迪暈⒆⑸浜笮∈笈嚀ヂ蚜巡模玻赴冢ǎ保埃埃兀╁義希疲椋紓澹玻靛澹玻澹悖澹斟澹螅簦幔紓邋澹澹恚猓潁錚簀澹穡潁錚洌酰悖澹溴澹猓澹悖歟澹幔觶幔紓邋澹幔媯簦澹蟈澹恚椋悖潁錚椋睿輳澹悖簦椋錚鑠澹ǎ保，

本文編號：2658189