【摘要】：犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)為副黏病毒科,副黏病毒亞科,麻疹病毒屬的成員,為不分節(jié)、非重疊單股負鏈RNA病毒,可引起犬瘟熱,侵害免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng),甚至神經系統(tǒng),從而導致全身性病理變化。目前對于犬瘟熱均采用疫苗免疫的方法進行預防控制,現(xiàn)階段犬瘟熱的預防疫苗主要為弱毒疫苗。但由于弱毒疫苗的大范圍推廣應用,使疫苗免疫與動物自然感染的區(qū)分變得非常困難,所以建立一種可以區(qū)分CDV野毒株和弱毒疫苗株的檢測方法已勢在必行。CDV檢測方法有多種,主要包括病毒分離培養(yǎng)、動物接種實驗、血清學診斷方法、RT-PCR和實時熒光定量PCR等。其中病毒分離培養(yǎng)和動物接種實驗均存在診斷周期長、操作繁瑣、檢出率低等問題;常規(guī)的血清學試驗在CDV臨床檢測上主要的是膠體金免疫層析試紙條,此方法由于操作簡單、快速,所以被廣泛使用,但同樣存在檢出率低和難以區(qū)分CDV野毒感染和疫苗免疫的不足。而目前能鑒別CDV野毒感染和疫苗免疫的方法為實時熒光定量PCR,此方法對實驗儀器的要求較高,并不適合臨床檢測。因此本課題采用AS-PCR核酸試紙條的方法來區(qū)分CDV野毒株和疫苗株。本試驗采集武漢地區(qū)患犬瘟熱的6只病犬的組織樣本和臨床上廣泛使用的2株CDV疫苗株進行全基因組測序,結合已知疫苗株CDV/R-20/8株全基因組序列,對6株野毒株和3株疫苗株的6個蛋白基因從氨基酸水平和堿基水平進行比對分析,發(fā)現(xiàn)F蛋白基因和H蛋白基因均有最大10%的差異,同時結合F蛋白和H蛋白2個蛋白在CDV感染過程中的功能,確定H基因為AS-PCR引物設計的靶基因。然后對6株野毒株和3株疫苗株進行分型,發(fā)現(xiàn)武漢地區(qū)流行的CDV均為Asia-Ⅰ型,而疫苗-1和疫苗-3(CDV/R-20/8株)為American-Ⅰ型,疫苗-2為American-II型,將NCBI上已有的CDV-H基因進行分型,篩出同為Asia-Ⅰ型的CDV-H基因共173株,對179株(6株已測序野毒株+篩出173株Asia-Ⅰ型)的CDV-H基因序列和3株疫苗株H基因序列比對分析,發(fā)現(xiàn)野毒株和疫苗株在H基因上有9個較穩(wěn)定的堿基變異位點,結合引物錯配原則設計71對AS-PCR引物;對71對AS-PCR區(qū)分引物進行驗證實驗,找到能夠區(qū)分CDV野毒株和疫苗株的AS-PCR引物分別是在H基因第469位堿基上G(Asia-Ⅰ型)→A(疫苗株),導致第157位氨基酸上V(Asia-Ⅰ型)→I(疫苗株)的變異位點設計的上游特異引物DI2F-157和H基因較保守區(qū)設計的下游通用引物DIR-15R;結合179株Asia-Ⅰ型的CDV-H基因統(tǒng)計堿基差異位點,對引物進行優(yōu)化,最后確定AS-PCR的上游特異引物:5’-TTAAAATGATTAATGACACTATGTG-3’,AS-PCR的下游通用引物:5’-CCTGGCAAGGCAAGAA-3’,并進行臨床驗證,臨床驗證結果顯示對臨床上已確定的犬瘟熱患犬陽性檢測達到70%,同時能夠區(qū)分出野毒株和疫苗株。對AS-PCR的上游特異引物標記生物素,AS-PCR下游通用引物標記FAM,確定鏈霉親和素標金的最適pH值和最適濃度,完成鏈霉親和素膠體金標記,把AntiFluorescein抗體劃線為檢測線,生物素化BSA劃線為質控線,之后按照核酸試紙條結構進行組裝,該核酸試紙條采用雙抗夾心法,CDV野毒株陽性樣本為檢測線和質控線雙線顯色,CDV疫苗株陰性樣本為質控線單線顯色。對核酸試紙條進行臨床驗證,發(fā)現(xiàn)該核酸試紙條能夠清楚區(qū)分CDV野毒株和疫苗株。該方法更簡單、快速、準確的檢測出犬瘟熱自然感染,以消除疫苗免疫在臨床上帶來的干擾。
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華中農業(yè)大學 2019 屆碩士研究生學位（畢業(yè)）論文—膠體金顆粒)出現(xiàn)顯色反應確定試紙條的是否正常，在檢測線上形成復合體(抗 B抗體—標記修飾分子 B 的核酸序列/標記修飾分子 A 的核酸序列—抗 A 抗體—膠體金顆粒)確定是否有目的條帶 ( Shan et al 2014，Quesada-González et al 2015，，吳剛等 2007，侯巧華 2016)。

圖 3.1 2 號犬瘟熱病毒全基因組拼接Fig 3.1 Whole genome splicing of canine distemper virus 2
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.655


本文編號：2658043