【摘要】：家禽的產(chǎn)蛋性能受到眾多因素的影響,但是影響家禽產(chǎn)蛋性狀的關(guān)鍵在于家禽卵泡發(fā)育的過程。本實(shí)驗(yàn)室前期通過高通量測序發(fā)現(xiàn)miR-458b-5p在開產(chǎn)與未開產(chǎn)母雞卵巢中差異表達(dá)。為研究miR-458b-5p在雞卵泡發(fā)育過程中的作用,本試驗(yàn)利用qRTPCR方法,檢測miR-458b-5p在卵泡中的表達(dá)情況,并根據(jù)高通量結(jié)果確定候選靶基因,進(jìn)而驗(yàn)證靶向關(guān)系,研究miR-458b-5p通過靶向調(diào)節(jié)靶基因?qū)﹄u等級卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響,試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,雞的miR-458b-5p在等級卵泡的膜細(xì)胞中高表達(dá),在顆粒細(xì)胞中低表達(dá),在這兩種卵泡細(xì)胞中的表達(dá)量差異顯著(P0.05)。靶基因CTNNB1在等級卵泡的顆粒細(xì)胞中高表達(dá),在膜細(xì)胞中低表達(dá),且在這兩種卵泡細(xì)胞中的表達(dá)量差異顯著(P0.05)。在等級卵泡中,隨著卵泡的增大,CTNNB1基因的表達(dá)量隨之減少,不同品種的母雞卵泡中,該趨勢接近一致。定量結(jié)果表明miR-458b-5p和CTNNB1基因的表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢。(2)利用Targetscan靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-458b-5p的靶基因?yàn)镃TNNB1基因。通過雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測試驗(yàn),轉(zhuǎn)染miR-458b-5p擬合物后導(dǎo)致野生型載體雙熒光素酶報(bào)告基因活性比值顯著下降(P0.05)。通過蛋白免疫印跡試驗(yàn)可以確定miR458b-5p能夠抑制β-catenin蛋白的合成。這些結(jié)果表明miR458b-5p與CTNNB1基因存在靶向關(guān)系,miR458b-5p可以通過定向結(jié)合CTNNB1基因的3'UTR,進(jìn)而抑制CTNNB1基因mRNA的翻譯。(3)根據(jù)CCK-8試劑對顆粒細(xì)胞的檢測結(jié)果來看,miR-458b-5p能夠抑制體外培養(yǎng)的雞等級卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測顆粒細(xì)胞凋亡情況的結(jié)果,證明miR-458b-5p不能引起雞等級卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。(4)miR-458b-5p的mimics轉(zhuǎn)染到雞的等級卵泡顆粒細(xì)胞后,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示其可以引起靶基因CTNNB1表達(dá)量的改變,進(jìn)而影響靶基因CTNNB1所在的Wnt/β-catenin信號通路內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生變化,說明miR-458b-5p確實(shí)會(huì)對Wnt/β-catenin信號通路產(chǎn)生一些影響。在轉(zhuǎn)染miR-458b-5p的雞等級卵泡的顆粒細(xì)胞中,LH受體表達(dá)量發(fā)生顯著變化,這個(gè)結(jié)果暗示黃體生成素與β-catenin蛋白的合成有某種關(guān)聯(lián)�？傊�,通過一系列的試驗(yàn)研究結(jié)果,可以證明gga-miR-458b-5p靶向調(diào)控靶基因CTNNB1,過表達(dá)gga-miR458b-5p擬合物會(huì)抑制雞等級卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的合成以及雞等級卵泡顆粒細(xì)胞的增殖,并在一定程度上影響Wnt/β-catenin信號通路一些相關(guān)基因的表達(dá)。
【圖文】：

雞卵巢中的各級卵泡Fig1.1Differentlevelsoffolliclesinchickenovaries

miRNA的生物合成Fig1.2BiosynthesisofmiRNA由于種子序列的特異性高，根據(jù)其差異性，，miRNAs被分為多個(gè)不同的小RNA家
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S831.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 戴燦;苗聰秀;盧光t;;基于重疊延伸PCR法的定點(diǎn)突變技術(shù)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年03期

本文編號：2655145