【摘要】：靜默狀態(tài)的原始卵泡是儲存卵母細(xì)胞的基本單位,其數(shù)量的高低決定了動物的繁殖壽命。豬卵巢原始卵母細(xì)胞數(shù)量高達(dá)百萬,然而終生排出并受孕的卵母細(xì)胞僅萬分之一,營養(yǎng)及飼養(yǎng)管理不當(dāng)引起原始卵泡激活不足或過度激活可能是導(dǎo)致母豬繁殖壽命縮短的主要原因之一。細(xì)胞內(nèi)感知營養(yǎng)代謝的關(guān)鍵分子mTOR是喚醒靜默狀態(tài)原始卵泡的必需信號通路,但營養(yǎng)能否通過mTOR影響原始卵泡激活報(bào)道較少。新近無脊椎動物上的研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)(而非碳水化合物和脂質(zhì))是影響動物壽命、繁殖衰老的關(guān)鍵營養(yǎng)素,而蛋白質(zhì)營養(yǎng)能否調(diào)控卵巢mTOR信號并影響原始卵泡激活及繁殖壽命尚不清楚。肝臟表達(dá)與分泌的FGF21是反映蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀態(tài)的關(guān)鍵代謝信號,可顯著影響細(xì)胞內(nèi)的mTOR信號,但FGF21能否參與蛋白質(zhì)營養(yǎng)調(diào)控卵巢mTOR信號及原始卵泡激活未見報(bào)道。鑒于此,本論文首先以母豬和小鼠為模型,明確蛋白限制及過量對卵巢原始卵泡激活的影響;進(jìn)一步通過卵巢體外培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因小鼠模型、關(guān)鍵營養(yǎng)信號的外源干預(yù)等手段,探明蛋白質(zhì)營養(yǎng)對卵巢原始卵泡激活的調(diào)控效應(yīng)及機(jī)制。研究分為5個(gè)試驗(yàn):試驗(yàn)一,飼糧蛋白限制對后備母豬原始卵泡激活及卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響。選擇40頭90日齡體重33kg的LY后備母豬,分別飼喂NRC推薦的正常蛋白(NP,100%SIDLys,n = 20)或蛋白限制(LP,50%SIDLys,n = 20)的飼糧,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)與NP組母豬相比,LP母豬不同時(shí)間點(diǎn)的血液中FGF21濃度顯著上升;(2)與NP組母豬相比,與對照組相比,LP組后備母豬初情日齡推遲9.9天(P =0.14),初情體重降低8.71kg(P0.05),初情背膘增加1.78mm(P0.05)。(3)日糧處理30天時(shí)分析母豬卵巢形態(tài)學(xué),與NP組相比,LP組母豬卵巢原始卵泡比例顯著增加(68.74 vs 80.39%,P= 0.012),初級卵泡(20.87 vs 15.47%,P= 0.062)和次級卵泡(9.46vs 3.31%,P = 0.040)的比例顯著降低,但不影響卵巢表面直徑為1～3mm有腔卵泡的數(shù)量;日糧處理至第三情期屠宰時(shí)分析母豬卵巢形態(tài)學(xué),NP和LP組母豬各級卵泡的比例差異不顯著,且不影響卵巢表面直徑為1～3mm有腔卵泡的數(shù)量,以及直徑≥3mm的大卵泡的數(shù)量;(4)日糧處理至第三情期時(shí),選擇NP和LP組母豬卵巢上直徑≥3mm的大卵泡卵母細(xì)胞卵丘細(xì)胞復(fù)合物(COCs)進(jìn)行體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)NP和LP組母豬COCs的體外卵丘擴(kuò)散率、卵母細(xì)胞極體排出率影響差異不顯著,說明卵母細(xì)胞質(zhì)量未受到日糧處理的影響;(5)通過WB檢測日糧處理30天和第三情期母豬卵巢與原始卵泡激活相關(guān)的蛋白表達(dá),與NP組母豬相比,LP組母豬卵巢mTOR及其下游靶蛋白S6的磷酸化水平顯著下降,與顆粒細(xì)胞增殖和卵母細(xì)胞生長相關(guān)蛋白ERK1/2的磷酸化水平顯著下降、AMPK磷酸化水平顯著上調(diào);以上結(jié)果說明:(1)飼糧蛋白限制降低母豬卵巢原始卵泡的激活,但不影響卵母細(xì)胞質(zhì)量;(2)血液FGF21濃度下降及卵巢mTORCl信號下調(diào)可能是飼糧蛋白限制降低卵巢原始卵泡激活的原因。試驗(yàn)二,蛋白限制及過量對小鼠原始卵泡激活及終生繁殖力的影響。選擇520只4周齡C57BL/6雌鼠為研究模型,分別飼喂蛋白限制(LP,CP8%)、正常蛋白(NP,CP20%)、蛋白過量(HP,CP50%)三種日糧,日糧處理4周、12周、24周、48周后收集卵巢(n=8～10)檢測原始卵泡與生長卵泡的數(shù)量及比例、卵巢蛋白表達(dá),并在日糧處理12周、24周、48周后每個(gè)處理組選擇20只雌鼠進(jìn)行配種試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)蛋白限制顯著提高日糧處理不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟Fgf21基因表達(dá)及血液FGF21濃度,蛋白過量顯著降低肝臟Fgf21基因表達(dá)及血液FGF21濃度;蛋白限制提高脂肪組織Adiponectin基因表達(dá)及血液脂聯(lián)素濃度,蛋白過量顯著降低脂肪組織Adiponectin基因表達(dá)及血液脂聯(lián)素濃度;(2)通過HE染色分析卵巢形態(tài)學(xué),發(fā)現(xiàn)蛋白限制顯著降低卵巢原始卵泡激活,表現(xiàn)在:卵巢原始卵泡數(shù)量和比例顯著增加、初級卵泡數(shù)量和比例顯著下降、初級卵泡與原始卵泡相對比例顯著下降;相反,蛋白過量顯著增加卵巢原始卵泡激活,表現(xiàn)在:卵巢原始卵泡數(shù)量和比例顯著下降、初級卵泡數(shù)量和比例顯著上升、初級卵泡與原始卵泡相對比例顯著增加;此外,蛋白限制顯著降低閉鎖卵泡數(shù)量及比例,蛋白過量顯著增加閉鎖卵泡數(shù)量及比例;(3)卵母細(xì)胞內(nèi)Pten,Lhx8,Foxo3a是維持原始卵泡靜默狀態(tài)的關(guān)鍵基因,日糧處理4周后,蛋白限制不同程度地上調(diào)卵母細(xì)胞內(nèi)Pten,Lhx8,Foxo3a的基因表達(dá),而蛋白過量不同程度地降低了卵母細(xì)胞內(nèi)Pten,Lhx8,Foxo3a的基因表達(dá);(4)日糧處理顯著影響卵巢上與原始卵泡激活相關(guān)的蛋白表達(dá):蛋白限制顯著下調(diào)卵巢mTOR及其下游靶蛋白S6的磷酸化水平,且下調(diào)了顆粒細(xì)胞增殖和卵母細(xì)胞生長相關(guān)蛋白ERK1/2的磷酸化水平;蛋白過量顯著上調(diào)卵巢mTOR、S6、ERK1/2的磷酸化水平;(5)通過免疫組化法檢測日糧處理4周小鼠卵巢的磷酸化蛋白表達(dá)可知,卵巢上磷酸化的S6蛋白主要表達(dá)在卵母細(xì)胞,而在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)較低;(6)日糧處理4周、12周、24周、48周后,每個(gè)處理組選擇12-20只雌鼠進(jìn)行排卵數(shù)測試,結(jié)果發(fā)現(xiàn)日糧處理4周、12周、24周對各處理組小鼠排卵數(shù)影響差異不顯著,但是日糧處理48周后,HP組小鼠排卵數(shù)顯著低于LP組;(7)日糧處理12周后每組選擇20只小鼠開展連續(xù)32周的配種測試,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各處理組小鼠的累計(jì)分娩胎次(LP:5.74、NP:6.32、HP:5.55)差異不顯著,LP組小鼠在配種后16周、20周、24周內(nèi)的累計(jì)產(chǎn)仔數(shù)顯著低于NP組,而28周和32周內(nèi)的累計(jì)產(chǎn)仔數(shù)各處理組之間差異不顯著;日糧處理24周后開展連續(xù)28周的配種測試,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LP組小鼠的累計(jì)分娩胎次具有顯著高于HP組的趨勢(3.78vs 2.64,P = 0.081),且HP組小鼠28周內(nèi)的累計(jì)產(chǎn)仔數(shù)具有顯著低于NP和LP組的趨勢(= 0.067);日糧處理48周后每組選擇20只小鼠開展連續(xù)8周的配種測試,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LP組小鼠第一胎次分娩的比例顯著高于HP組(35%vs 5%,P0.05),且連續(xù)配種8周后LP組小鼠累計(jì)產(chǎn)仔數(shù)高于HP組(25只vs2只);以上結(jié)果說明:(1)蛋白限制降低卵巢mTORCl信號并抑制原始卵泡激活,蛋白過量上調(diào)卵巢mTORCl信號并促進(jìn)原始卵泡激活;(2)短期(12周)飼喂蛋白過量日糧不損害繁殖力,長期蛋白過量降低卵泡庫并損害繁殖力。試驗(yàn)三,蛋白質(zhì)營養(yǎng)信號對體外培養(yǎng)卵巢原始卵泡激活的調(diào)控及機(jī)制。以體外培養(yǎng)新生小鼠卵巢為模型,考察蛋白質(zhì)營養(yǎng)三種關(guān)鍵代謝信號(氨基酸、FGF21、脂聯(lián)素)對體外培養(yǎng)卵巢原始卵泡激活的影響。(1)根據(jù)試驗(yàn)二飼喂LP、NP、HP日糧小鼠餐后血液氨基酸組成,設(shè)計(jì)不同氨基酸水平(LP-AA:3.93 mM,LP-AA:5.14 mM,LP-AA:7.74 mM)的培養(yǎng)基,考察氨基酸水平(無氨基酸、LP-AA、LP-AA、LP-AA)對體外培養(yǎng)卵巢原始卵泡激活及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無氨基酸處理顯著抑制了體外培養(yǎng)卵巢原始卵泡的激活,mTOR及下游靶蛋白S6的磷酸化水平顯著下調(diào),而LP-AA、LP-AA、LP-AA各處理組間卵巢原始卵泡激活、mTOR、S6蛋白磷酸化水平影響差異不顯著;(2)設(shè)計(jì)不同濃度的FGF21(0,50,200,I000ng/ml)處理體外培養(yǎng)卵巢,發(fā)現(xiàn)FGF21對體外培養(yǎng)卵巢原始卵泡激活、mTORCl信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)影響差異不顯著;(3)設(shè)計(jì)不同濃度脂聯(lián)素(0,5,15,30μg/ml)處理體外培養(yǎng)卵巢,發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素(15,30μg/ml)處理顯著抑制了卵巢原始卵泡的激活,同時(shí)卵巢AMPK磷酸化水平顯著上調(diào),mTOR及下游靶蛋白S6磷酸化水平顯著下降;研究進(jìn)一步使用AMPK信號抑制劑Compound C處理體外培養(yǎng)卵巢,考察AMPK信號在脂聯(lián)素調(diào)控卵巢原始卵泡激活中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Compound C雖然顯著抑制了脂聯(lián)素引起的AMPK磷酸化,但是并未恢復(fù)S6的磷酸化及原始卵泡的激活至對照組水平;以上結(jié)果說明:(1)氨基酸是卵巢原始卵泡激活的必需營養(yǎng)素,但是當(dāng)氨基酸滿足原始卵泡激活的基本需求后,再增加氨基酸水平對原始卵泡的激活沒有影響;(2)FGF21不能直接作用于卵巢調(diào)控原始卵泡激活;(3)脂聯(lián)素能夠抑制體外培養(yǎng)卵巢原始卵泡的激活,該過程不依賴AMPK信號。試驗(yàn)四,肝臟FGF21在蛋白質(zhì)營養(yǎng)調(diào)控卵巢原始卵泡激活中的作用。由于肝臟分泌FGF21的首要靶器官是脂肪組織,且研究已經(jīng)證實(shí)FGF21對代謝的調(diào)控依賴脂聯(lián)素的表達(dá)與分泌,因此本試驗(yàn)采用FGF21肝臟特異性敲除(FGF21LKO)小鼠為模型,驗(yàn)證蛋白質(zhì)營養(yǎng)關(guān)鍵信號FGF21是否通過脂聯(lián)素間接調(diào)控原始卵泡激活。選擇28日齡野生型(WT)及FGF21LKO小鼠,采用2×3因子設(shè)計(jì),對WT和FGF21LKO小鼠飼喂LP、NP、HP三種日糧,日糧處理12周后考察血液激素分泌、卵巢卵泡發(fā)育及蛋白表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)蛋白限制顯著增加脂肪組織Adiponectin基因表達(dá)及血液脂聯(lián)素濃度,肝臟FGF21敲除后,蛋白限制組小鼠脂肪組織Adiponectin基因表達(dá)及血液脂聯(lián)素濃度恢復(fù)至NP組水平;(2)蛋白限制顯著增加野生型小鼠卵巢原始卵泡的數(shù)量和比例,降低初級卵泡的比例,蛋白過量顯著降低野生型小鼠卵巢原始卵泡的數(shù)量和比例,增加初級卵泡的數(shù)量和比例;肝臟FGF21敲除后,各處理組原始卵泡和初級卵泡的數(shù)量和比例差異不顯著。(3)日糧處理、肝臟FGF21、肝臟FGF21與日糧交互效應(yīng)顯著影響了卵巢mTOR蛋白磷酸化水平,肝臟FGF21敲除后,NP和HP組小鼠卵巢mTOR蛋白磷酸化水平進(jìn)一步提高;飼喂LP日糧的野生型小鼠卵巢S6蛋白磷酸化顯著低于NP和HP組,但肝臟FGF21敲除后,各處理組小鼠卵巢S6磷酸化水平差異不顯著。以上結(jié)果說明:(1)肝臟FGF21參與了蛋白質(zhì)營養(yǎng)調(diào)控原始卵泡激活;(2)蛋白限制降低原始卵泡激活的原因,與FGF21刺激脂聯(lián)素的表達(dá)與分泌有關(guān)。試驗(yàn)五,脂聯(lián)素受體激動劑AdipoRon對卵巢原始卵泡過度激活的保護(hù)效應(yīng)。鑒于體外試驗(yàn)及動物試驗(yàn)均已證明脂聯(lián)素參與蛋白質(zhì)營養(yǎng)調(diào)控卵巢原始卵泡激活,本試驗(yàn)考察外源處理脂聯(lián)素受體激動劑AdipoRon能否保護(hù)蛋白過量引起的原始卵泡過度激活。本試驗(yàn)分為兩部分:(1)首先通過體外卵巢培養(yǎng)試驗(yàn),比較了 AdipoRon與脂聯(lián)素對卵巢原始卵泡激活及mTORCl信號的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):脂聯(lián)素的處理濃度為15和30μg/ml時(shí),顯著上調(diào)了 AMPK磷酸化水平,下調(diào)S6的磷酸化水平,原始卵泡的激活受到顯著抑制;AdipoRon的處理濃度為25mM和50mM時(shí),顯著上調(diào)了 AMPK磷酸化水平,下調(diào)S6的磷酸化水平,原始卵泡的激活受到顯著抑制,說明AdipoRon與脂聯(lián)素在抑制原始卵泡激活及mTORCl信號方面具有相似的調(diào)控效應(yīng);(2)研究進(jìn)一步采用2×3因子設(shè)計(jì),對LP、NP、HP日糧處理的28日齡雌性小鼠,按50mg/kg.天的劑量,進(jìn)行連續(xù)28天的AdipoRon灌胃處理,研究發(fā)現(xiàn):未進(jìn)行AdipoRon處理時(shí),LP組小鼠原始卵泡數(shù)量和比例顯著高于NP和HP組,初級卵泡比例顯著低于HP組,mTORCl信號顯著下調(diào),AMPK信號顯著上調(diào);進(jìn)行AdipoRon處理后,HP組小鼠原始卵泡數(shù)量和比例降低至LP組水平,且各處理組間卵巢mTOR、S6、AMPK蛋白磷酸化水平差異不顯著;以上結(jié)果說明:脂聯(lián)素受體激動劑AdipoRon與脂聯(lián)素對卵巢原始卵泡激活具有相似的調(diào)控效應(yīng),外源處理AdipoRon能夠防止蛋白過量引起的原始卵泡過度激活。基于試驗(yàn)一至試驗(yàn)五的結(jié)果,本論文得到以下結(jié)論:(1)蛋白限制降低原始卵泡激活,蛋白過量增加原始卵泡激活;(2)卵巢mTORCl信號是蛋白質(zhì)營養(yǎng)調(diào)控原始卵泡激活的關(guān)鍵信號;(3)蛋白限制增強(qiáng)肝臟FGF21分泌,蛋白過量降低肝臟FGF21分泌,FGF21通過影響脂聯(lián)素的分泌間接調(diào)控卵巢mTORCl信號及原始卵泡激活。
【圖文】：

研宄表明［２９］，母豬的原始卵泡庫主要形成于妊娠７０－９０天，其數(shù)量可高達(dá)百萬，為逡逑母豬的繁殖活動提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。豬的原始卵泡從生后３周開始緩慢激活，在２０？５０ｋｇ逡逑階段大量激活［５］。對哺乳動物而言，原始卵泡在生后主要存在三種命運(yùn)（見圖１）邋［６］：第逡逑一，保持靜默狀態(tài)，在母體整個(gè)生命中等待被喚醒；第二，原始卵泡在外部因素刺激下逡逑喚醒成為生長卵泡，并經(jīng)歷初級卵泡、次級卵泡、有腔卵泡、成熟卵泡發(fā)育階段最終排逡逑出成熟的卵丘細(xì)胞－卵母細(xì)胞復(fù)合物（Ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ邋ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，邋ＣＯＣｓ），若生長卵泡逡逑發(fā)育受阻則發(fā)生閉鎖、退化；第三，，部分靜默狀態(tài)的原始卵泡通過程序性凋亡、自噬、逡逑或其他未知途徑死亡。由于哺乳動物在生后缺乏生殖干細(xì)胞［３Ｑ］，在宮內(nèi)發(fā)育時(shí)期建立的逡逑原始卵泡庫是動物成年后生殖細(xì)胞的唯一來源。因此原始卵泡的激活必須受到嚴(yán)格的控逡逑制，一旦原始卵泡過度激活就會導(dǎo)致卵泡庫過早耗竭而發(fā)生卵巢早衰癥（Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ逡逑ｏｖａｒｉａｎ邋ｆａｉｌｕｒｅ，ＰＯＦ）。ＰＯＦ在人上的發(fā)生率為１％，一旦發(fā)生卵巢早衰，則會導(dǎo)致婦女逡逑生育能力不可逆地喪失［３１］。小鼠初生時(shí)原始卵泡４０００？６０００個(gè)

通路［３４］，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞內(nèi)淲脂酰肌醇３激酶（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ邋３邋ｋｉｎａｓｅ，邋Ｗ３Ｋ）邋／ｍＴＯＲ逡逑信號通路是維持卵母細(xì)胞靜默狀態(tài)的關(guān)鍵信號。其他課題組的研宄相繼證實(shí)，爐５］、逡逑７ｉｃ７［３６］、１r潰郟常罰鋇然潁跡玻粒�，抠pü煌耐揪兌種坡涯趕赴詰模校桑常耍恚裕希義義閑藕磐罰匾煨緣厙貿(mào)鮮齷虻賈侶涯趕赴冢校桑常耍恚裕希倚藕磐吩鑾浚悸雅蒎義霞せ畈⒆晃ぢ雅藎郟常福蕁ｅ義希村義

本文編號：2649688