【摘要】：毛發(fā)是哺乳動物最為顯著的外在特征之一,是由嵌入皮膚內(nèi)的迷你器官—毛囊所產(chǎn)生。毛囊主要由真皮層和表皮層兩類細胞構成,其中屬于真皮層的毛乳頭細胞是毛囊的“信號中心”,它們通過分泌諸多生長因子和細胞因子等信號分子控制著毛囊表皮層細胞的增殖和分化。屬于表皮層的毛母質(zhì)細胞是形成毛發(fā)各類細胞的前體細胞,它們是在毛囊干細胞被激活后遷移到毛囊毛球部所形成的細胞群體,其快速增殖和終末分化最終形成持續(xù)不斷生長的毛發(fā)。絨山羊是我國重要的絨毛用經(jīng)濟動物之一,探索毛囊發(fā)育的分子機制是提高絨毛產(chǎn)量和質(zhì)量的基礎性工作。因此,了解毛乳頭細胞信號分子表達調(diào)控和毛母質(zhì)細胞增殖及分化的相關機理是解析毛囊發(fā)育的關鍵科學問題。本研究旨在獲取毛乳頭細胞的全轉錄組表達譜數(shù)據(jù),并探索毛乳頭細胞和毛母質(zhì)細胞間信號互作的分子機制,為上述科學問題的解決提供參考信息。本研究內(nèi)容共包括:1)分離培養(yǎng)絨山羊毛囊毛乳頭細胞和成纖維細胞,建立起兩類細胞的全轉錄組學數(shù)據(jù),通過比較分析篩選影響毛囊發(fā)育的編碼基因和非編碼基因;2)探索與篩選到的功能基因CRABP1和LEPR相關的小分子物質(zhì)全反式視黃酸和瘦素在毛乳頭細胞內(nèi)的功能;3)建立并優(yōu)化毛母質(zhì)細胞體外培養(yǎng)的技術體系;4)通過細胞共培養(yǎng)和RNA-seq技術探索毛乳頭細胞和毛母質(zhì)細胞分子互作的機制。主要研究成果如下:1.成功地采用顯微解剖法和組織塊培養(yǎng)法分別獲取了絨山羊的毛乳頭細胞和皮膚成纖維細胞;兩類細胞具有顯著不同的形態(tài)特征,毛乳頭細胞呈扁平狀和多角形,而成纖維細胞呈細長的紡錘絲狀;對兩類細胞進行全轉錄組學建譜共鑒定到mRNAs43766條,lncRNAs 2540條,TUCP 759條,miRNAs 536條,circRNAs 3706條。2.毛乳頭細胞和成纖維細胞共存在差異表達mRNAs 2538條,其中毛乳頭細胞中表達上調(diào)1286條,下調(diào)1252條;lncRNAs 71條,其中上調(diào)18條,下調(diào)53條;TUCP18條,上調(diào)3條,下調(diào)15條;circRNAs 121條,上調(diào)76條,下調(diào)45條;miRNAs86條,上調(diào)42條,下調(diào)44條;對毛乳頭細胞中上調(diào)的基因及差異表達非編碼基因的靶基因進行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),粘附斑、胞外基質(zhì)-受體互作和調(diào)節(jié)干細胞多潛能性信號通路等信號通路得到富集。同時,雌激素信號通路、脂肪因子信號通路和甲狀腺激素信號通路等與激素相關的信號通路也得到富集。3.將絨山羊毛乳頭細胞上調(diào)基因同小鼠毛乳頭細胞的標記基因取交集分析發(fā)現(xiàn)25個核心基因,包括SPP1、LEPR、WNT5A、PTGFR、RSPO1、HOXC8和MAGED2等;進一步對涉毛囊干細胞激活相關的基因HOXC8和RSPO1進行分析發(fā)現(xiàn),它們的表達可能受到chi-miR-144-5P、lnc_000335和lnc_001710等非編碼基因的正向和負向調(diào)控;同時,一些特定的lncRNAs和circRNAs如XR_310320.3和chi_circ_000573可能會作為內(nèi)源競爭性RNAs分子吸附抑制上述基因表達的miRNAs如chi-miR-144-5P等從而上調(diào)相關基因的表達。4.視黃酸信號通路相關基因CRABP1和RARβ高表達于毛乳頭細胞內(nèi);外源性的全反式視黃酸抑制毛乳頭細胞的活力,誘導毛乳頭細胞的凋亡,增加毛乳頭細胞處于細胞周期G1期的比例,而減少G2期比例;全反式視黃酸處理后毛乳頭細胞中CRABP1和RARβ的表達量顯著上調(diào)(P0.05),而FGF7表達量顯著下調(diào)(P0.05);全反式視黃酸在轉錄水平抑制FGF7的表達,且RARβ在FGF7基因啟動子區(qū)域存在8個結合位點。LEPR的mRNA和蛋白表達水平在毛乳頭細胞中都顯著地高于成纖維細胞;外源重組瘦素處理提高了毛乳頭細胞的細胞活力,同時也顯著地增加了FGF7和IGF-1的表達量(P0.05)。5.成功地采用顯微解剖法分離培養(yǎng)了絨山羊毛母質(zhì)細胞,原代和傳代培養(yǎng)的毛母質(zhì)細胞都呈典型的角質(zhì)化細胞樣的鋪路石狀形態(tài);對培養(yǎng)條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn),無鈣RPMI1640是最優(yōu)的培養(yǎng)基,而Coating Matrix和Collagen Type IV是最優(yōu)的培養(yǎng)皿包被介質(zhì);毛母質(zhì)細胞的體外倍增時間為23.60小時;毛母質(zhì)細胞標記基因如HOXC13和SOX21等的表達在mRNA和蛋白水平顯著地高于毛乳頭細胞(P0.05)。6.鈣離子促進毛母質(zhì)細胞內(nèi)角質(zhì)化細胞分化相關基因loricrin、involucrin和KRT1的表達,提高了毛母質(zhì)細胞的增殖比例,但對細胞周期沒有影響。全反式視黃酸促進了毛母質(zhì)細胞的增殖,減少毛母質(zhì)細胞處于細胞周期G1期的比例,而增加了處于G2期和S期的比例;全反式視黃酸增加了毛母質(zhì)細胞內(nèi)CRABP1和RARβ的表達量(P0.05),也促進了involucrin基因的表達(P0.05)。7.Transwell直接共培養(yǎng)改變了毛乳頭細胞和毛母質(zhì)細胞的細胞周期分布,體現(xiàn)在共培養(yǎng)的毛乳頭細胞處于S期的細胞比例顯著地高于單獨培養(yǎng)的毛乳頭細胞(P0.05)。同時,共培養(yǎng)的毛母質(zhì)細胞處于G1期細胞比例顯著減少(P0.05),G2期和S期顯著增加(P0.05)。8.共培養(yǎng)改變了兩類細胞的基因表達模式,體現(xiàn)在共培養(yǎng)條件下毛乳頭細胞上調(diào)基因3358個,包括已知的功能基因如FGF7、FGF10、WNT5A和IL-6等,下調(diào)基因2843個。共培養(yǎng)時毛母質(zhì)細胞上調(diào)基因3436個,包括誘導毛乳頭細胞表達生長因子的基因IL-1A等;下調(diào)基因3059個,包括編碼角蛋白的基因如KRT17等和對角蛋白表達起調(diào)控作用的基因如HOXC13等。綜上所述,本研究通過對毛乳頭細胞和成纖維細胞進行全轉錄組建譜和分析篩選到了大量影響毛囊生長和發(fā)育的候選編碼和非編碼基因,并構建了非編碼基因對關鍵編碼基因的調(diào)控關系和互作網(wǎng)絡;通過挖掘相關數(shù)據(jù),本研究探索了全反式視黃酸和瘦素對毛乳頭細胞體外培養(yǎng)的作用,為進一步闡述它們對毛囊的影響提供了理論基礎。同時,本研究還成功地建立并優(yōu)化了毛母質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)體系,并借此探索了毛乳頭細胞和毛母質(zhì)細胞體外互作的分子機制,為進一步探索毛囊發(fā)育的分子機制提供良好的細胞模型和可靠的候選基因。
【圖文】：

圖 1-1 哺乳動物毛囊形態(tài)發(fā)生的一般過程及關鍵分子(Schmidt-Ullrich and Paus 200Figure 1-1 Processes and the key molecules of the morphogenesis of animal hair follicle通過以小鼠為模型進行基因敲除或敲入等基因操作，研究人員發(fā)現(xiàn)了大量的發(fā)生相關的信號分子及通路如 Wnt/β-catenin、Eda/Edar、FGFs、TGFβ/B13 等(Millar 2002; Stenn 2003; Madaan et al. 2018)。K14 基因啟動子驅動的 路抑制因子 Dkk1 的異位表達會導致毛囊形態(tài)轉變和細胞分化之前的基板形而且還阻止了類似毛囊的結構如牙齒和乳腺在毛芽階段之前的發(fā)育(And)。Edar 基因的突變也有類似的效應，會致使小鼠毛發(fā)在形態(tài)發(fā)生過程中沒成，機制是導致基板特異性基因如 Bmp4、Lef1 和 Shh 等的表達缺失(Laurik02)。此外，Lef1、Noggin、Shh 和 Gli2 等都與毛囊的形態(tài)發(fā)生過程有密切的它們在毛囊形態(tài)發(fā)生不同階段所起的作用是不同的(Zhou et al. 1995; Chian; Botchkarev et al. 2002; Mill 2003)。類似的機制也出現(xiàn)在絨山羊毛囊的發(fā)育過Gao等(2016)通過轉錄組測序技術對不同階段絨山羊胎兒皮膚的基因表達譜現(xiàn)，HOXC13、LHX2、MSX2 和 PAD3 等同小鼠毛囊角質(zhì)化細胞分化相關的羊毛囊發(fā)育的不同階段差異性表達，說明這些基因都也參與了絨山羊毛囊發(fā)

圖 1-2 毛囊周期循環(huán)示意圖(Alonso 2006)Figure 1-2 The hair cycle1.2 毛乳頭細胞研究進展毛乳頭細胞是位于毛囊底部的一類特化的成纖維細胞，，它們在毛囊形態(tài)發(fā)生和周期循環(huán)中有舉足輕重的作用，被認為是毛囊的“信號中心”(Karlsson et al. 1999; Kulessa eal. 2000)。它們不僅決定著毛囊的周期性發(fā)育，還影響著毛囊的大小及毛發(fā)纖維的粗細等(Yano et al. 2001; Driskell et al. 2012; Morgan 2014)。毛乳頭細胞也可以作為許多激素、神經(jīng)小肽、小分子化合物及神經(jīng)遞質(zhì)等諸多小分子物質(zhì)的靶標，進而間接性地參與這些激素類物質(zhì)對毛囊周期的調(diào)控(Oh and Smart 1996b; van Beek et al. 2008; Paus et al. 2014Toyoshima and Tsuji 2017)。此外，困擾人類群體的雄性脫發(fā)疾病也與毛乳頭細胞促進毛囊角質(zhì)化細胞的增殖和分化功能的缺失有關(Inui et al. 2002, 2003; Inui and Itam2011)。因此，毛乳頭細胞參與毛囊生物學各個方面的分子機制得到研究人員廣泛的關注(Madaan et al. 2018)。同時，研究人員也建立起了毛乳頭細胞體外培養(yǎng)的技術體系，
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S827


本文編號：2647287