【摘要】：鉤端螺旋體(鉤體)分為致病性問號(hào)鉤體和非致病性腐生型雙曲鉤體兩類。鉤體病是由致病性的鉤體引起的一種廣泛傳播的自然疫源性人畜共患病,豬、馬、牛、羊以及人類都可感染此病,引起發(fā)熱、黃疸、流產(chǎn)甚至死亡,給我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康造成了極大危害。到目前為止,鉤體病的詳細(xì)發(fā)病機(jī)理還不能被完全闡明。鉤體侵入動(dòng)物體后,能迅速擴(kuò)散至全身各個(gè)組織器官。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體對(duì)病原菌識(shí)別防御的第一道防線。研究宿主天然免疫系統(tǒng)對(duì)鉤端螺旋體的識(shí)別及反應(yīng)機(jī)制,對(duì)鉤端螺旋體病的防治具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)鉤體能夠激活細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體——TLR2和TLR4,也可以激活胞內(nèi)的模式識(shí)別受體——NLRP3。TLR2,TLR4的激活能啟動(dòng)核轉(zhuǎn)錄因子Nf-κB和MAPK信號(hào)通路,使細(xì)胞因子IL-1β,IL-6,TNF-a等大量表達(dá)。而NLRP3炎性體的激活需要兩個(gè)信號(hào),第一個(gè)信號(hào)是TLRs介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄合成,第二個(gè)信號(hào)是通過與接頭蛋白ASC結(jié)合,并招募Pro-caspase-1形成為 炎性小體‖的復(fù)合物,激活caspase-1,從而對(duì)Pro-IL-1β等底物進(jìn)行切割,使其成熟并釋放到胞外。應(yīng)用小鼠基因缺陷模型,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺陷TLR4或同時(shí)缺陷TLR2和TLR4的小鼠感染鉤體后迅速死亡,但對(duì)于金黃地鼠及其他敏感動(dòng)物來說,他們體內(nèi)并不缺陷TLR2和TLR4,這些敏感動(dòng)物在鉤端螺旋體感染過程中,其體內(nèi)的TLR2和TLR4到底發(fā)揮了怎樣的功能還不清楚。由于鉤體可以迅速穿透細(xì)胞膜,進(jìn)入胞內(nèi),那么除NLRP3以外,胞漿中的其他炎性體是否也能識(shí)別侵入胞內(nèi)的鉤體呢?耐受動(dòng)物與敏感動(dòng)物感染鉤體后,這些受體的作用是否也有差異?對(duì)這些問題的解答將進(jìn)一步揭示鉤體的致病機(jī)制,為開發(fā)新的靶向防控生物制劑奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。因此,本論文從先天免疫識(shí)別受體的角度出發(fā),通過對(duì)比鉤體感染的兩種動(dòng)物模型——金黃地鼠敏感模型和小鼠耐受模型,探索TLR2、TLR4以及胞內(nèi)炎性體(NLRP3、NLRC4)在鉤端螺旋體感染過程中發(fā)揮的作用及機(jī)制,進(jìn)而探究以調(diào)節(jié)TLR2,TLR4及NLRP3、NLRC4炎性體信號(hào)通絡(luò)為靶點(diǎn)的藥物在抗鉤端螺旋體感染中的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示,鉤體感染后,金黃地鼠體內(nèi)TLR2的表達(dá)要明顯滯后于BALB/c小鼠,而TLR4的表達(dá)沒有明顯的差異,因此,TLR2前期不表達(dá)或不激活可能是金黃地鼠對(duì)鉤體易感的原因。為了驗(yàn)證上面的假設(shè),TLR2缺陷的C57小鼠被用來接種鉤體,同時(shí),用TLR2的激動(dòng)劑Pam3CSK4來治療感染鉤體的金黃地鼠,發(fā)現(xiàn)TLR2缺陷加重了小鼠感染鉤體后的病理變化,相應(yīng)的,應(yīng)用TLR2激動(dòng)劑Pam3CSK4則提高了金黃地鼠感染鉤體后的存活率,表明TLR2的前期激活能有效控制鉤體感染。為進(jìn)一步探索TLR2發(fā)揮作用的分子機(jī)制,分析比較了TLR2下游的細(xì)胞因子在兩種動(dòng)物模型中的表達(dá)差異,并檢測(cè)了IL-10/TNF-α比值在野生型和TLR2缺陷型C57小鼠中,以及Pam3CSK4處理的金黃地鼠中的變化情況。發(fā)現(xiàn)TLR2的表達(dá)與IL-10有一定的協(xié)同性,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明鉤體引起的IL-10表達(dá)是由TLR2介導(dǎo)的。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TLR2的激活能有效控制鉤體感染,該過程可能是通過提高IL-10水平或IL-10/TNF-α比值來實(shí)現(xiàn)的。對(duì)比金黃地鼠和C57小鼠感染鉤體后NLRP3和NLRC4基因的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)金黃地鼠中NLRP3的表達(dá)明顯滯后于小鼠,而NLRC4在兩種動(dòng)物感染前期都不表達(dá),后期表達(dá)差異不大,表明NLRP3的差異表達(dá)可能是造成小鼠和金黃地鼠模型不同轉(zhuǎn)歸的原因。隨后,應(yīng)用NLRP3缺陷的C57小鼠,發(fā)現(xiàn)雖然野生型和NLRP3缺陷小鼠感染鉤體后存活率沒有差異,但NLRP3缺陷鼠體內(nèi)的鉤體量更低,組織病理變化更緩和,并且器官中IL-1β的水平與體內(nèi)鉤體量不相關(guān),提示NLRP3缺陷后對(duì)鉤體清除作用的加強(qiáng)并不依賴下游的IL-1β。為進(jìn)一步證明以上觀點(diǎn),提取NLRP3、NLRC4、Caspase-11、Caspase-1-11缺陷的C57小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)鉤體引起的IL-1β主要依賴NLRP3炎性體,應(yīng)用雙醋瑞因(IL-1β抑制劑)來治療感染鉤體后的C57小鼠和金黃地鼠,卻沒有提高感染鉤體后小鼠和金黃地鼠的存活率,而且也沒有降低小鼠體內(nèi)的鉤體含量,表明NLRP3缺陷后對(duì)鉤體清除作用的加強(qiáng)并不依賴下游IL-1β的降低。NLRP3除介導(dǎo)IL-1β的成熟外,還能影響細(xì)胞自噬,NLRP3缺陷后對(duì)鉤體的清除作用的加強(qiáng)是否依賴于細(xì)胞自噬水平的提高呢?本實(shí)驗(yàn)中NLRP3缺陷明顯提高了C57小鼠腎臟的自噬水平。盡管金黃地鼠感染鉤體后NLRP3的表達(dá)滯后于C57小鼠,但體內(nèi)自噬水平并沒有升高,反而遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于C57小鼠,以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NLRP3缺陷能加速體內(nèi)鉤體的清除,該過程可能是通過提高細(xì)胞自噬水平來實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證TLR2和NLRP3在控制鉤體感染過程中的作用,選擇當(dāng)前治療鉤體病的首選藥物--多西環(huán)素進(jìn)行了體內(nèi)體外驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素在治療鉤體病時(shí),除發(fā)揮一般的抗菌作用外,還能特異性的抑制IL-1β的表達(dá)和分泌,并且能夠提高宿主TLR2的表達(dá),同時(shí)抑制NLRP3的表達(dá),進(jìn)一步研究表明,多西環(huán)素還抑制了TLR2下游的NF-κB和MAPK信號(hào)通路,并且抑制了NLRP3炎性體激活的Priming階段,以上結(jié)果通過多西環(huán)素間接證明,提高TLR2,抑制NLRP3,有助于鉤體病的治療。綜上所述,TLR2和NLRP3在鉤體感染過程中發(fā)揮了重要作用。TLR2的激活能有效控制鉤體感染,該過程可能是通過提高IL-10水平或IL-10/TNF-α比值來實(shí)現(xiàn)的。NLRP3缺陷能加速體內(nèi)鉤體的清除,該過程可能是通過提高細(xì)胞自噬水平來實(shí)現(xiàn)的。多西環(huán)素提高了鉤體引起的TLR2的表達(dá),同時(shí)抑制了NLRP3的表達(dá)及NLRP3炎性體激活的priming階段。提示應(yīng)用能夠提高TLR2,抑制NLRP3表達(dá)的藥物可能有助于鉤體病的治療。
【圖文】：

圖 2.1 鉤體的補(bǔ)體逃避途徑（圖片引自：Fraga T R, BarbosaAS, Isaac L. Leptospirosis: aspects of innaunity, immunopathogenesis and immune evasion from the complement systeScandinavian journal of immunology, 2011, 73(5): 408-419.）Fig 2.1 Complement escape of leptospira除了將 FH 吸引到表面之外，鉤體還能結(jié)合人的 C4BP（經(jīng)典和凝集補(bǔ)的一種關(guān)鍵抑制劑）[105]。致病性鉤體能從人的血清中獲得大量的 C4BP力的鉤體，如 Patoc，僅能捕獲少量的 C4BP。結(jié)合到鉤體表面的 C4BP性，說明有毒力的鉤體可能通過捕獲這種補(bǔ)體通路調(diào)節(jié)劑來抵抗血清的。最近，，發(fā)現(xiàn)鉤體外膜蛋白中存在一個(gè) 20-KDa 的 LcpA，可以與補(bǔ)體通直接結(jié)合[106]，部分或完全抵抗補(bǔ)體殺傷途徑的鉤體表達(dá) LcpA，并將其體表面，捕獲人血清中的 C4BP，C4BP 與 LcpA 結(jié)合后，仍有活性，作

圖 2.2 模式識(shí)別受體對(duì)鉤體的識(shí)別Fig 2.2 Pattern recognition receptors and leptospira2.2.2 胞內(nèi)炎性體對(duì)鉤體的識(shí)別除 TLR2 和 TLR4 外，鉤體還能激活胞內(nèi)的 NLRP3 炎性體[138]（圖 2-2）。炎性復(fù)合體（Inflammasomes）是由胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體 NLRs 和 ALRs 家族成員參與組裝的多蛋白復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。目前已鑒定出NLRP3、NLRP1、NLRC4 和 AIM2 等多種炎性體，其各自的裝配形式及對(duì)革蘭氏陰性菌的識(shí)別及功能如圖2-3所示，其中NLRP3炎性體的研究最為深入[139-141]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎性復(fù)合體由 NLRP3、接頭蛋白 ASC 和 Caspase-1 組成，可以被細(xì)菌PAMPs和毒素[142-145]、病毒[146-149]，真菌[150-152]，寄生蟲[153]，以及ATP[142]、尿酸單鈉結(jié)晶[154]、淀粉樣纖維 B[155]等 DAMPs 激活，從而激活半胱氨酸蛋白酶
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S855.99

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本文編號(hào)：2646059