發(fā)布時(shí)間：2020-04-30 05:12

【摘要】：在奶牛乳腺上皮細(xì)胞(CMEC)中,氨基酸(AA)是酪蛋白基因表達(dá)與翻譯的重要調(diào)控因子。AA主要通過(guò)雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mTORC1)通路調(diào)控酪蛋白合成,但AA調(diào)控mTORC1上游通路的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究的目的是確定奶牛乳腺上皮細(xì)胞中Sestrin2(SESN2)在氨基酸調(diào)控酪蛋白合成中的作用機(jī)理,完善氨基酸調(diào)控酪蛋白合成的信號(hào)通路。SESN2負(fù)向調(diào)控氨基酸誘導(dǎo)的酪蛋白合成對(duì)CMEC進(jìn)行添加全部AA、添加必需AA和不添加AA處理,用MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印記和免疫熒光等方法檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞中酪蛋白、SESN2的表達(dá)及mTORC1通路的活化。結(jié)果表明,添加AA后,細(xì)胞增殖、細(xì)胞中酪蛋白的表達(dá)及mTORCl通路的活化均顯著增加,但SESN2的表達(dá)顯著下降;對(duì)CMEC進(jìn)行Sesn2基因過(guò)表達(dá)或干擾處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Sesn2基因過(guò)表達(dá)后,細(xì)胞增殖、細(xì)胞中酪蛋白的表達(dá)及mTORC1通路的活化均顯著降低,且Sesn2基因過(guò)表達(dá)能抑制AA誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、細(xì)胞中酪蛋白的表達(dá)及mTORCl通路的活化,反之亦然。這說(shuō)明,SESN2能抑制AA誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、酪蛋白合成和mTORC1通路活化。SESN2通過(guò)SH3BP4負(fù)向調(diào)控氨基酸誘導(dǎo)的酪蛋白合成用免疫共沉淀(Co-IP)、QE質(zhì)譜等技術(shù)鑒定SESN2的相互作用蛋白,結(jié)果表明,共鑒定到SESN2的互作蛋白108個(gè),其中包括mTORC1上游通路相關(guān)的LAMTOR4、SH3BP4、TSC1等;試驗(yàn)選擇SH3區(qū)域結(jié)合蛋白4(SH3BP4)進(jìn)行后續(xù)研究。對(duì)CMEC進(jìn)行Sh3bp4基因過(guò)表達(dá)或干擾處理,檢測(cè)SH3BP4對(duì)SESN2調(diào)控mTORC1的影響。結(jié)果表明,Sh3bp4基因干擾能抑制SESN2過(guò)表達(dá)對(duì)mTORC1的抑制,反之亦然;對(duì)CMEC進(jìn)行Sesn2基因過(guò)表達(dá)或干擾處理,檢測(cè)SESN2對(duì)SH3BP4與Rag　GTPase結(jié)合的影響。結(jié)果表明,SESN2過(guò)表達(dá)能促進(jìn)SH3BP4與Rag　GTPase的結(jié)合,反之亦然。這說(shuō)明,SESN2通過(guò)促進(jìn)SH3BP4與Rag　GTPase結(jié)合來(lái)抑制mTORC1通路;對(duì)CMEC進(jìn)行Atf4基因過(guò)表達(dá)或干擾,結(jié)果表明,AA缺乏通過(guò)ATF4促進(jìn)SESN2的表達(dá)。SESN2通過(guò)GNG12負(fù)向調(diào)控氨基酸誘導(dǎo)的酪蛋白合成用SWATH鑒定CMEC的溶酶體膜蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GNG12與AA誘導(dǎo)的酪蛋白合成有關(guān);對(duì)CMEC進(jìn)行GngI2基因過(guò)表達(dá)或干擾,結(jié)果表明GNG12能促進(jìn)AA誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、酪蛋白合成和mTORC1通路活化;用Co-IP鑒定GNG12的互作蛋白,結(jié)果表明,GNG12能與Ragulator結(jié)合;對(duì)CMEC進(jìn)行p18(Ragulator亞基之一)基因過(guò)表達(dá)或干擾,結(jié)果表明,GNG12通過(guò)Ragulator調(diào)控mTORC1通路;對(duì)CMEC進(jìn)行Sesn2基因過(guò)表達(dá)或干擾,結(jié)果表明,SESN2抑制細(xì)胞中GNG12的表達(dá)及溶酶體定位。綜上所述,在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中,SESN2是酪蛋白合成的負(fù)調(diào)控因子。氨基酸缺乏促進(jìn)ATF4表達(dá),并使其進(jìn)入細(xì)胞核,激活Sesn2的轉(zhuǎn)錄,上調(diào)SESN2表達(dá),并促進(jìn)表達(dá)的SESN2從兩方面抑制mTORC1通路及酪蛋白合成。一是SESN2與SH3BP4結(jié)合,促進(jìn)SH3BP4對(duì)Rag GTPase的抑制,從而抑制mTORC1通路的活化及酪蛋白的合成;二是SESN2抑制氨基酸誘導(dǎo)的GNG12的表達(dá)及其對(duì)Ragu1ator的激活,從而抑制mTORC1通路的激活及酪蛋白的合成。
【圖文】：

牛奶中乳蛋白含量的高低是衡量牛奶好壞的重要指標(biāo)。在奶牛體內(nèi)，乳蛋白是在奶牛乳腺上逡逑皮細(xì)胞中合成的。奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白的合成受包括激素、營(yíng)養(yǎng)素和環(huán)境因素等在內(nèi)的多逡逑重因素調(diào)控。乳蛋白合成的調(diào)控是一個(gè)多因素、多水平的非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程（圖１－１邋ＸＢｉｏｎｚａ，逡逑ｅｔ邋ａＬ，２０１１；邋Ｏｓｏｒｉｏ，邋ｅｔａｌ＿，２０１６）。逡逑ｕ乳蛋白合成的調(diào)控因素逡逑奶牛乳腺乳蛋白合成受多種因素的調(diào)控，其中激素和營(yíng)養(yǎng)素是兩個(gè)很重要的因素（Ｙａｎｇ，邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００５；邋Ｔｏｎｇ，ｅｔａｌ．，２０１１；林忠荔，等，２０１４；周苗苗，等，，２０１５）。逡逑Ｌ１．１激素逡逑乳腺的生長(zhǎng)發(fā)育及其各種生理功能的發(fā)揮均有賴于各種相關(guān)內(nèi)分泌激素的共同作用（Ｓｔｒａｎｇｅ，逡逑ｅｔａｌ．，邋１９９１；邋０１ｉｔａｎｉ，ｅｔａｌ．，２０１１；邋Ａｏ，ｅｔａｌ．，２０１５）。參與調(diào)控的主要激素包括催乳素、胰島素、氫逡逑化可的松、生長(zhǎng)激素、雌激素、孕酮、腎上腺皮質(zhì)激素等（Ｅｌｙ，ｅｔａｌ．，邋１９７６；邋Ｚｈａｏ，邋ｅｔａｌ．，２００７；逡逑Ｚｈａｎｇ，邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１４邋）。逡逑泌乳相關(guān)激素（即：催乳素、氫化可的松和胰島素）對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的功能分化及啟動(dòng)和維逡逑持泌乳來(lái)說(shuō)是非常重要的（Ａｈｎ

在ｍＴＯＲＣｌ下游主要是ｍＴＯＲＣｌ被磷酸化激活后，一方面磷酸化激活Ｓ６Ｋ１，活化逡逑的Ｓ６Ｋ１磷酸化激活核糖體蛋內(nèi)Ｓ６，促進(jìn)蛋Ａ質(zhì)的翻譯；另一方面，磷酸化的ｍＴＯＲ使４ＥＢＰ１逡逑磷酸化，從而使ｅＩＦ４Ｅ從４ＥＢＰ１上釋放，參與翻譯起始（圖１－２）（駱超超，等，２０１５）。逡逑Ａｍｉｎｓ邋ａｃｉｄｓ邐ＣＥＰＲＬＪｎｓａｉｉａ．ｅｔｅ．逡逑？？得邋｜邋？vqＴ逡逑廣＾邐邐逡逑＂邋ｍＴＯ，邋一，ＰＲＡＳ４０逡逑圖１－２：邋ｍＴＯＲＣｌ信號(hào)通路逡逑Ｆｉｇ．ｌ－２：邋ｍＴＯＲＣｌ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ逡逑在ＡＡ對(duì)ｍＴＯＲＣｌ上游的調(diào)控，即ＡＡ如何激活ｍＴＯＲＣｌ方面，還眾說(shuō)紛繪，沒(méi)有很明確的調(diào)逡逑控通路（Ｈａｙ，邋ｅｔａｌ．，２００４）。目前主要有如下幾個(gè)調(diào)控途徑。逡逑１）邋“ｉｎｓｉｄｅ－ｏｕｔ”調(diào)控模式逡逑目甜研究發(fā)現(xiàn)，在ＡＡ激活ｍＴＯＲＣｌ過(guò)程中，溶酶體是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞器，ｍＴＯＲＣ］逡逑被募集到溶酶體是其被激活的前提，即接受ＡＡ信號(hào)后，ｍＴＯＲＣｌ是先被募集到溶酶體上，然后逡逑被激活的（Ｋｉｍ，邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００８；邋Ｐｒｏｕｄ，邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１１；邋Ａｖｅｒｏｕｓ，邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１４）。對(duì)邋ＡＡ邋激活邋ｍＴＯＲＣｌ邋的逡逑途徑，有學(xué)者根據(jù)目前的研究提出了“ｉｎＳ１ｄｅ－０ｕｔ”模式，即ＡＡ先進(jìn)入溶酶體內(nèi)，然后在溶酶體內(nèi)逡逑部通過(guò)激活一系列信號(hào)分了進(jìn)而募集并激活ｍＴＯＲＣｌ邋（Ｚｏｎｃｕ
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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1 張璐;韓薇;;Sestrins的表達(dá)調(diào)控及其在代謝疾病、衰老研究中的進(jìn)展[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2015年12期

2 周苗苗;崔景香;;牛乳蛋白合成調(diào)控研究進(jìn)展[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年20期

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本文編號(hào)：2645431