發(fā)布時間：2020-04-23 00:22

【摘要】：十二指腸賈第蟲(Giardia duodenalis)簡稱賈第蟲,是一種重要的人獸共患原蟲,由賈第蟲寄生在宿主小腸中,感染并引起的賈第蟲病(giardiasis)呈世界性分布,其引起感染者的主要癥狀是腹瀉。賈第蟲的宿主廣泛,包括多種脊椎動物。賈第蟲屬于單細(xì)胞真核生物,其結(jié)構(gòu)簡單,基因含量少且緊湊,編碼區(qū)極短。賈第蟲生活史非常簡單,僅有感染期可長期抵抗外界不良環(huán)境而存在的包囊和成熟期可復(fù)制繁衍導(dǎo)致疾病產(chǎn)生的滋養(yǎng)體兩個階段。人類由于食用或飲用了被包囊污染的食物和水而引起賈第蟲感染,賈第蟲常導(dǎo)致宿主腹瀉、惡心、嘔吐和體重減輕,還可引起腸易激綜合征(IBS)、食物過敏、關(guān)節(jié)炎或慢性疲勞綜合癥等多種并發(fā)癥。營養(yǎng)狀況、免疫狀態(tài)、混合感染和腸道正常菌群的差異都會影響賈第蟲的感染能力。賈第蟲屬于真核生物的分支,位于真核生物進(jìn)化的底端,是研究高等真核生物進(jìn)化的重要生物模型。近年來,可編輯核酸酶的引入極大提高了基因組編輯的效率。目前研究人員使用最廣泛的是CRISPR工具,應(yīng)用該工具切斷基因組雙鏈DNA,從而產(chǎn)生基因組的變異。CRISPR/Cas9屬于II型CRISPR系統(tǒng),最初是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的,有兩種關(guān)鍵性構(gòu)建核心:Cas9蛋白和sgRNA,sgRNA由tracrRNA和crRNA結(jié)合的復(fù)合物組成,在細(xì)胞內(nèi)被內(nèi)切酶III水解間隔區(qū)和部分重復(fù)序列形成成熟的sgRNA。在最后一步干擾中,sgRNA將Cas9蛋白引導(dǎo)到一個與sgRNA互補的靶序列然后將其降解。在構(gòu)建細(xì)胞的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)時,需要構(gòu)建出表達(dá)sgRNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒,質(zhì)粒中插入抗藥基因表達(dá)盒,借助轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒運送至細(xì)胞,再用藥物篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,進(jìn)行基因編輯研究。這種編輯方法比傳統(tǒng)方法更簡便和省時,目前已經(jīng)應(yīng)用在各種生物領(lǐng)域。本研究以CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一的sgRNA為研究對象,構(gòu)建出賈第蟲sgRNA瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體。實驗分析了已發(fā)表文章的錐蟲和弓形蟲中的敲除載體中的功能元件,并預(yù)測了賈第蟲U6啟動子,將錐蟲U6、弓形蟲18S rRNA的兩種外源啟動子和預(yù)測的賈第蟲內(nèi)源的U6啟動子作為sgRNA的候選啟動子來啟動sgRNA的轉(zhuǎn)錄。以pBluescript II SK(+)為真核轉(zhuǎn)染載體骨架,將三種sgRNA表達(dá)盒插入pBluescript質(zhì)粒,構(gòu)建且鑒定成功后,利用質(zhì)粒大提的方法將三種質(zhì)粒提取純化,通過電穿孔的方式將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入賈第蟲細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24 h后提取滋養(yǎng)體總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,qPCR分析三種啟動子的啟動效果和能力。鑒定成功的質(zhì)粒再通過電轉(zhuǎn)染至賈第蟲之后,取不同時間點進(jìn)行qPCR檢測,分析瞬時轉(zhuǎn)染sgRNA的表達(dá)時間。為檢驗3’UTR對sgRNA的轉(zhuǎn)錄是否有影響,本研究將U6的3’UTR用插入到瞬時轉(zhuǎn)染載體中sgRNA基因的3’端,構(gòu)建出pBSK-GU5-sgRNA-GU3質(zhì)粒,將pBSK-GU5-sgRNA和pBSK-GU5-sgRNA-GU3兩種質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)染賈第蟲后,用qPCR技術(shù)分析兩種載體的sgRNA的表達(dá)量。在鑒定成功的轉(zhuǎn)染載體內(nèi)插入NEO表達(dá)盒構(gòu)建出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體pBSK-GU5-sgRNA-RNR,同時通過G418濃度梯度培養(yǎng)賈第蟲來確定G418對賈第蟲的最小致死量。用內(nèi)切酶將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒線性化并回收之后用電轉(zhuǎn)染至賈第蟲內(nèi),在含G418藥物的培養(yǎng)基中篩選出sgRNA穩(wěn)定表達(dá)蟲株,提取基因組DNA,PCR鑒定NEO和sgRNA基因。通過以上研究,本研究成功構(gòu)建出sgRNA瞬時轉(zhuǎn)染載體,并用qPCR技術(shù)檢測到sgRNA成功被賈第蟲U6啟動子轉(zhuǎn)錄,其瞬時表達(dá)時間為6 d,再插入NEO表達(dá)盒構(gòu)建出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體,通過轉(zhuǎn)染之后的G418藥物篩選,本研究成功得到穩(wěn)定表達(dá)sgRNA的抗G418蟲株,并用PCR方法鑒定出sgRNA及NEO基因,表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗成功。本研究同時通過實驗證明賈第蟲U6的3’UTR對sgRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)無顯著影響。本研究通過預(yù)測及篩選分析,成功得到賈第蟲內(nèi)源性sgRNA啟動子,在賈第蟲內(nèi)成功地進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,為CRISPR/Cas9系統(tǒng)在賈第蟲中的成功建立及利用該技術(shù)對賈第蟲基因功能的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 賈第蟲的集聚體及感染人類的分型[10]Fig. 1-1 The assemblage of Giardia and typing of infected humans[10].2 賈第蟲的流行病學(xué)賈第蟲病在世界范圍內(nèi)普遍存在，患者的主要病狀是腹瀉，除此之外還可有腹痛、和吸收不良的臨床癥狀。慢性感染患者常為無癥狀。發(fā)病癥狀常在感染初期的第]。全世界國家和地區(qū)的感染者比例為 1%~30%，每年大約有 2.8 億人感染。其中發(fā)染率為 0.2%~29.2%，而在發(fā)展中國家賈第蟲感染率普遍較高，可達(dá)到 8%~30%[18-間差異較大的主要的原因是賈第蟲主要是水源性傳播，發(fā)展中國家經(jīng)濟和衛(wèi)生條件賈第蟲的傳播較廣泛，易呈暴發(fā)性流行。在美國，人們將賈第蟲列為頭號危險腸道而在加拿大、澳大利亞等發(fā)達(dá)國家，也存在有賈第蟲流行，甚至是大流行。發(fā)展中者占主要數(shù)量，賈第蟲感染率在馬來西亞為 16%~18%，在烏干達(dá)甚至達(dá)到 40.7%[感染在我國各個城市和地區(qū)均有分布，感染率為 0.4%~16.2%[22]，每年約有 2850 萬，超過全球總感染者的 10%[23,24]�？傮w來講，我國國內(nèi)的沿海和西部地區(qū)的賈第蟲高；農(nóng)村居民比城鎮(zhèn)居民感染率高；兒童比成人感染率高。其原因主要是沿海地區(qū)，，利于賈第蟲的傳播；偏遠(yuǎn)地區(qū)及農(nóng)村衛(wèi)生環(huán)境較差，習(xí)慣飲用生水；兒童衛(wèi)生習(xí)

圖 1-2 賈第蟲生活史[36]Fig. 1-2 The life cycle of Giardia[36]4 賈第蟲的致病機制賈第蟲病是一種由多個原因?qū)е碌募膊。磻?yīng)了宿主與寄生蟲之間復(fù)雜的相互作是非侵入性的感染，附著在小腸的上皮細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制繁殖。目前對引起賈第蟲病完全清楚，賈第蟲對寄主上皮細(xì)胞有一定的損傷作用，這是一個受宿主遺傳變異免疫因素影響的過程。賈第蟲附著在上皮細(xì)胞，釋放效應(yīng)分子進(jìn)入細(xì)胞胞漿，并特別是膜破壞毒素。賈第蟲在宿主上皮細(xì)胞的附著程度是決定這些的毒力的重要第蟲與宿主細(xì)胞接觸時會產(chǎn)生有害物質(zhì)。研究人員在賈第蟲中發(fā)現(xiàn)了幾種分泌產(chǎn)認(rèn)為可幫助賈第蟲滋養(yǎng)體黏附在人類的腸道上。在賈第蟲建立可用于基因敲除研統(tǒng)，可幫助建立或確認(rèn)已知或假定的毒力因子的作用[37]。賈第蟲病的發(fā)病時間通 7~12 天之后，患者感染后常見的臨床癥狀是腹瀉（有時帶有吸收不良綜合征）、和體重減輕[38]。感染者中有些人僅有很輕微的癥狀并能夠自愈；另一些感染者則嚴(yán)重的病癥，并且在經(jīng)過常規(guī)治療之后不能實現(xiàn)治愈。大多數(shù)的感染者是處于這慢性賈第蟲感染可導(dǎo)致腸易激綜合征（IBS）、食物過敏、關(guān)節(jié)炎或慢性疲勞綜合
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.72

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本文編號：2637144