【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是一種由鐮刀菌屬菌株產(chǎn)生的非甾體伴雌激素樣作用的霉菌毒素,其污染遍布世界各地。ZEA的毒性作用見于生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等,但相關(guān)機(jī)制尤其是分子機(jī)制還沒有完全探明。目前,關(guān)于ZEA暴露對(duì)動(dòng)物免疫細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞活化功能的研究報(bào)道較少,為探究ZEA免疫毒性的機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)以分離的小鼠原代T淋巴細(xì)胞為材料,研究了 ZEA對(duì)T細(xì)胞體外活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及活化過程中相關(guān)免疫功能的影響。1.ZEA對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞活性及活化標(biāo)志信號(hào)的影響采用免疫磁珠負(fù)性分選等技術(shù)從6-8周齡Balb/c小鼠脾臟中分離獲得原代T淋巴細(xì)胞,以0(空白對(duì)照),2.5,5,10,20,40,80μM的ZEA同時(shí)處理未添加/添加活化劑ConA(5μg/mL)的淋巴細(xì)胞48h、72h、96h,CCK-8法檢測ZEA對(duì)T細(xì)胞活力的影響;96孔U型底培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞觀察細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象;流式細(xì)胞術(shù)檢測ZEA對(duì)T細(xì)胞各期活化分子的表達(dá)。結(jié)果顯示,未添加ConA的各染毒組T細(xì)胞的活性與對(duì)照組相比均無明顯變化(p0.05);Con A對(duì)照組與空白對(duì)照組相比細(xì)胞活性均明顯上升(pp0.01);48h時(shí)20μM ZEA及以上濃度處理組細(xì)胞活性均明顯低于Con A組(p0.05或p0.01),72h及96h時(shí)1 0μM ZEA及以上濃度處理組細(xì)胞活性均較ConA組極顯著下降(p0.01),并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。96孔U型培養(yǎng)板培養(yǎng)72h后,空白對(duì)照組細(xì)胞幾乎看不到克隆團(tuán),ConA組出現(xiàn)了大量的克隆團(tuán);10μMZEA處理組細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象受到抑制,20μM及40μMZEA處理組細(xì)胞聚集團(tuán)開始產(chǎn)生皺縮。雙熒光染色流式檢測顯示,與空白對(duì)照組比較,ConA組T細(xì)胞早、中、晚期活化標(biāo)志蛋白CD69、CD25、CD71均有大量表達(dá)(p0.01);與ConA對(duì)照組相比,10μM ZEA及以上濃度處理組T細(xì)胞CD69、CD25、CD71陽性表達(dá)率均有下降(p0.05或p0.01),并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。2.ZEA對(duì)TCR信號(hào)通路的影響以小鼠原代T淋巴細(xì)胞為材料,設(shè)立空白對(duì)照組(不含ConA)、ConA(5μμg/mL)對(duì)照組、ZEA(20 及 40μM)+ConA(5μg/mL)處理組,共同處理 24h 后,利用 westernblot方法檢測TCR信號(hào)通路中接頭蛋白LAT的表達(dá)水平,活化起始調(diào)控蛋白Lck、Zap-70的表達(dá)和磷酸化水平,T淋巴細(xì)胞活化核因子NF-AT通路和NF-κB通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平,以及核因子NF-AT和NF-κB入核表達(dá)的情況;利用流式細(xì)胞術(shù)分析了不同濃度ZEA(10、20及40μM)對(duì)ConA刺激下的T淋巴細(xì)胞TCR通路中共刺激分子CD28、CD152的影響。westemblot檢測不同濃度ZEA(20μM及40μM)對(duì)ConA刺激下的T淋巴細(xì)胞活化共刺激分子CD28介導(dǎo)的下游PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示,Con A組細(xì)胞LAT表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯上升(p0.01),不同濃度ZEA處理組LAT的表達(dá)量均較Con A組顯著下降(p0.01),不同濃度ZEA處理組Lck、Zap-70的表達(dá)水平及其磷酸化水平均較Con A組下降(p0.01)并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,不同濃度ZEA處理組活化核因子NF-AT、NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量及它們?nèi)牒吮磉_(dá)水平均較ConA組下降(p0.05)。隨ZEA染毒濃度的升高,細(xì)胞CD28的表達(dá)水平呈下降趨勢,40μM ZEA處理組較Con A組差異顯著(p0.05);10、20μM ZEA處理組細(xì)胞CD152分子的表達(dá)水平均較Con A組顯著下降(p0.05),40μM ZEA處理組細(xì)胞CD152表達(dá)水平較Con A組卻差異不顯著(p0.05)。不同濃度ZEA處理組細(xì)胞CD28介導(dǎo)的下游PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量均較Con A組顯著下降(p0.05或p0.01)。3.ZEA對(duì)活化T細(xì)胞細(xì)胞因子、趨化因子分泌及趨化因子受體表達(dá)的影響以小鼠原代T淋巴細(xì)胞為材料,設(shè)立空白對(duì)照組(不含ConA)、ConA(5μng/mL)對(duì)照組、ZEA(10、20及40μM)+Con A(5μg/mL)處理組,共同處理培養(yǎng)48h、72h后,利用流式液相多重蛋白定量技術(shù)檢測細(xì)胞因子IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、GM-CSF及趨化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平;染毒培養(yǎng)24h后,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞趨化因子受體CCR2和CCR7的表達(dá)。結(jié)果顯示,ConA組細(xì)胞因子IL-2、IL-3、IL5、IL6、GM-CSF及趨化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平均較空白對(duì)照組極顯著升高(p0.01),各濃度ZEA處理組IL-2、IL-3、IL5、IL6、GM-CSF等五種細(xì)胞因子的分泌均較ConA組極顯著下降(p0.01)且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系;隨ZEA染毒濃度的升高,細(xì)胞趨化因子MIP-1α和RANTES的分泌水平呈下降趨勢,20μM ZEA及以上濃度處理組MIP-1α分泌量較Con A組顯著降低(p0.05),40μM ZEA處理組RANTES分泌量較Con A顯著降低(pp0.05);流式雙染結(jié)果顯示,Con A組T細(xì)胞趨化因子受體CCR2和CCR7的表達(dá)量均較空白組極顯著升高(p0.01),隨ZEA染毒濃度的升高,T細(xì)胞趨化因子受體CCR2和CCR7的表達(dá)量均呈下降趨勢,20μM ZEA及以上濃度處理組CCR2表達(dá)量較Con A組顯著降低(p0.05),40[μMZEA處理組CCR7表達(dá)量較ConA組顯著降低(pp0.05)結(jié)論,ZEA可通過干擾TCR及共刺激信號(hào)通路抑制經(jīng)Con A刺激的T淋巴細(xì)胞活化過程,同時(shí)可以抑制活化T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及趨化因子的功能,并在一定程度上抑制T細(xì)胞參與的趨化效應(yīng),從而導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體發(fā)生免疫抑制。
【圖文】：

：玉米赤霉烯酮對(duì)小鼠Ｔ淋巴細(xì)胞活化的影響及機(jī)制章細(xì)胞免疫應(yīng)答與Ｔ淋巴細(xì)胞活主要指由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的各種免疫效應(yīng)作用，，其的識(shí)別是Ｔ細(xì)胞對(duì)抗原進(jìn)行免疫應(yīng)答的起始階段，面抗原受體，與抗原遞呈細(xì)胞（ＡＰＣ）表面的－ＭＨＣ異性結(jié)合，此時(shí)，抗原識(shí)別過程開始。當(dāng)信號(hào)傳應(yīng)受體ＴＣＲ發(fā)生特異性結(jié)合而啟動(dòng)時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。這一過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致Ｔ細(xì)胞活化，發(fā)生胞因子［４５］。逡逑Ｌｙｍｐｈ邋ｎｏｄ？邐，邐Ｔｕｍｏｒ邋ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ逡逑

ＰＤ．Ｌ１邋０逡逑！邋Ｘ逡逑ＣＣＲ４逡逑圖２－１細(xì)胞免疫發(fā)生過程逡逑１Ｔ細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)逡逑抗體與循環(huán)或組織液中的外源入侵微生物結(jié)合，之后將其破壞消滅，然而并非所有的逡逑入侵微生物都生活在細(xì)胞外，病毒和某些細(xì)菌寄生在細(xì)胞內(nèi)抗體達(dá)不到的部位，因此抗體逡逑在保護(hù)機(jī)體抵抗這些入侵者方面的作用有限，病毒和其他細(xì)胞內(nèi)感染的微生物，必須通過逡逑其他機(jī)制進(jìn)行消滅［４６，４７］。對(duì)此，機(jī)體采用兩種不同的方法：要么使感染細(xì)胞被快速殺死，逡逑使得入侵的微生物沒有生長的時(shí)間，要么使感染細(xì)胞產(chǎn)生消滅胞內(nèi)微生物的能力。在這之逡逑中，Ｔ細(xì)胞介導(dǎo)的各種免疫效應(yīng)發(fā)揮了重要的作用。逡逑１．１細(xì)胞毒性Ｔ細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡途徑逡逑細(xì)胞能殺死自己，機(jī)體在需要時(shí)誘導(dǎo)其衰老、過剩、損傷或異常的細(xì)胞死亡，否則它逡逑們會(huì)干擾正常組織功能
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S859.8

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本文編號(hào)：2636349