【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是嚴(yán)重危害禽業(yè)的傳染病之一,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將此列為必報(bào)傳染病。預(yù)防ND的主要手段以接種疫苗為主,目前市場(chǎng)上主要的疫苗對(duì)基因Ⅶ型ND保護(hù)效果欠佳,因此研究針對(duì)基因Ⅶ型ND疫苗具有重要意義。DNA疫苗作為繼第一代疫苗(微生物疫苗)和第二代疫苗(亞單位疫苗)后的第三代疫苗,能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。為了研究針對(duì)基因Ⅶ型ND的DNA疫苗,本研究將真核表達(dá)密碼子優(yōu)化的F基因連接到真核表達(dá)載體pYA4545上,構(gòu)建了CMV啟動(dòng)子控制的真核表達(dá)質(zhì)粒pYA4545-pUC-F-opt-Flag,命名為pYA4545-F。為了增強(qiáng)免疫效果,將含有原核啟動(dòng)子Ptrc的雞白介素18(chicken interferon 18,cIL-18)基因片段連接到pYA4545-F上,構(gòu)建雙啟動(dòng)子共表達(dá)的pYA4545-pUC-F-opt-Ptrc-cIL18-TT-Flag質(zhì)粒,命名為pYA4545-F-IL18。分別將pYA4545-F及pYA4545-F-IL18質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到延遲裂解型沙門菌載體χ11218中,口服免疫雛雞后評(píng)價(jià)其免疫效應(yīng)。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)制備及反應(yīng)原性分析首先,以優(yōu)化過密碼子的F基因pUC-F-opt為模板,構(gòu)建出攜帶Flag標(biāo)簽的pUC-F-opt-Flag,將其與真核表達(dá)載體pYA4545連接構(gòu)建pYA4545-F真核表達(dá)質(zhì)粒。其次,以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的質(zhì)粒pYA3342-cIL-18為模板設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增包括原核啟動(dòng)子Ptrc、cIL-18片段及終止子TT的片段Ptrc-cIL18-TT,將其與之前構(gòu)建好的pYA4545-pUC-F-opt-Flag質(zhì)粒連接,構(gòu)建含有雙表達(dá)啟動(dòng)子(CMV真核啟動(dòng)子及Ptrc原核啟動(dòng)子)的pYA4545-F-IL18質(zhì)粒,進(jìn)而通過WesternBlot和間接免疫熒光的方法確認(rèn)F蛋白和cIL18蛋白成功表達(dá),且具有良好的免疫原性。將質(zhì)粒pYA4545-F和pYA4545-F-IL18電轉(zhuǎn)進(jìn)入延遲裂解型沙門菌載體中獲得重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)(2)重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)免疫保護(hù)效果比較與評(píng)價(jià)通過免疫保護(hù)試驗(yàn)對(duì)重組沙門菌的免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。將100只1日齡雛雞分為5組,每組20只,于第7日、第21日口服接種免疫實(shí)驗(yàn)組χ11218(pYA4545)組、χ11218(pYA4545-F)組和χ11218(pYA4545-F-IL18)組),生理鹽水對(duì)照組口服等量生理鹽水,NDV滅活疫苗組僅在第14天頸部皮下注射免疫。35日齡時(shí),對(duì)各組雛雞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟和外周血中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化,結(jié)果顯示重組菌能使T、B淋巴細(xì)胞增多,產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答。MTT法檢測(cè)免疫后雛雞法氏囊B淋巴細(xì)胞增殖能力,結(jié)果表明χ11218(pYA4545-F)組和χ11218(pYA4545-F-IL18)組的B淋巴細(xì)胞對(duì)PMA的刺激有明顯的反應(yīng)性,證明重組菌能提高雞法氏囊B淋巴細(xì)胞的增殖能力。ELISA方法檢測(cè)血清中NDV抗體含量、IL-4含量、IL-18含量和腸道灌洗液中IgA含量,結(jié)果表明重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)能提高血清中NDV抗體、IL-4、IL-18以及腸道灌洗液中IgA含量。同時(shí)免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示:重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)能對(duì)基因Ⅶ型ND具有一定免疫保護(hù)效果。病理切片結(jié)果顯示χ11218(pYA4545-F)組、χ11218(pYA4545-F-IL18)組雖沒有滅活疫苗組保護(hù)效果好但與生理鹽水組和χ11218(pYA4545)組相比胸腺組織和肺組織病理變化較輕。以上結(jié)果說(shuō)明了重組沙門菌具有較好的保護(hù)作用,為以延遲裂解性沙門菌作為ND疫苗活載體提供了理論依據(jù),為新城疫DNA疫苗的提供了新思路。
【圖文】：

圖 1.1: 質(zhì)粒 pYA4545-F 和 pYA4545-F-IL18 的質(zhì)粒圖譜Fig.1.1: Plasmid maps of pYA4545-F and pYA4545-F-IL181.2.2 攜帶 Flag 標(biāo)簽的 pUC-F-opt 基因的擴(kuò)增

1.1 pUC-F-opt 基因片段擴(kuò)增結(jié)果子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 ：pUC-F-opt 基因片.1 Amplification of pUC-F-opt genes Marker ； 1： Product for pUC-F-o
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 沙萬(wàn)里;宋泰;尹柏雙;王奔;宋永利;閆滿;宮宇宏;;新城疫病毒F-HN基因DNA疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)[J];吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報(bào);2014年01期

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1 翟崇凱;攜帶NDV HN/F基因的重組減毒雞白痢沙門菌構(gòu)建及其特性[D];河南科技大學(xué);2017年

2 尚珂;重組NDV HN基因減毒雞白痢沙門菌的構(gòu)建及其特性研究[D];河南科技大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：2633951