【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是嚴重危害禽業(yè)的傳染病之一,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將此列為必報傳染病。預(yù)防ND的主要手段以接種疫苗為主,目前市場上主要的疫苗對基因Ⅶ型ND保護效果欠佳,因此研究針對基因Ⅶ型ND疫苗具有重要意義。DNA疫苗作為繼第一代疫苗(微生物疫苗)和第二代疫苗(亞單位疫苗)后的第三代疫苗,能誘導體液免疫和細胞免疫。為了研究針對基因Ⅶ型ND的DNA疫苗,本研究將真核表達密碼子優(yōu)化的F基因連接到真核表達載體pYA4545上,構(gòu)建了CMV啟動子控制的真核表達質(zhì)粒pYA4545-pUC-F-opt-Flag,命名為pYA4545-F。為了增強免疫效果,將含有原核啟動子Ptrc的雞白介素18(chicken interferon 18,cIL-18)基因片段連接到pYA4545-F上,構(gòu)建雙啟動子共表達的pYA4545-pUC-F-opt-Ptrc-cIL18-TT-Flag質(zhì)粒,命名為pYA4545-F-IL18。分別將pYA4545-F及pYA4545-F-IL18質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到延遲裂解型沙門菌載體χ11218中,口服免疫雛雞后評價其免疫效應(yīng)。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)制備及反應(yīng)原性分析首先,以優(yōu)化過密碼子的F基因pUC-F-opt為模板,構(gòu)建出攜帶Flag標簽的pUC-F-opt-Flag,將其與真核表達載體pYA4545連接構(gòu)建pYA4545-F真核表達質(zhì)粒。其次,以本實驗室構(gòu)建的質(zhì)粒pYA3342-cIL-18為模板設(shè)計引物,擴增包括原核啟動子Ptrc、cIL-18片段及終止子TT的片段Ptrc-cIL18-TT,將其與之前構(gòu)建好的pYA4545-pUC-F-opt-Flag質(zhì)粒連接,構(gòu)建含有雙表達啟動子(CMV真核啟動子及Ptrc原核啟動子)的pYA4545-F-IL18質(zhì)粒,進而通過WesternBlot和間接免疫熒光的方法確認F蛋白和cIL18蛋白成功表達,且具有良好的免疫原性。將質(zhì)粒pYA4545-F和pYA4545-F-IL18電轉(zhuǎn)進入延遲裂解型沙門菌載體中獲得重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)(2)重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)免疫保護效果比較與評價通過免疫保護試驗對重組沙門菌的免疫保護效果進行評價。將100只1日齡雛雞分為5組,每組20只,于第7日、第21日口服接種免疫實驗組χ11218(pYA4545)組、χ11218(pYA4545-F)組和χ11218(pYA4545-F-IL18)組),生理鹽水對照組口服等量生理鹽水,NDV滅活疫苗組僅在第14天頸部皮下注射免疫。35日齡時,對各組雛雞進行實驗分析,通過流式細胞術(shù)檢測脾臟和外周血中T淋巴細胞和B淋巴細胞數(shù)量的變化,結(jié)果顯示重組菌能使T、B淋巴細胞增多,產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答。MTT法檢測免疫后雛雞法氏囊B淋巴細胞增殖能力,結(jié)果表明χ11218(pYA4545-F)組和χ11218(pYA4545-F-IL18)組的B淋巴細胞對PMA的刺激有明顯的反應(yīng)性,證明重組菌能提高雞法氏囊B淋巴細胞的增殖能力。ELISA方法檢測血清中NDV抗體含量、IL-4含量、IL-18含量和腸道灌洗液中IgA含量,結(jié)果表明重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)能提高血清中NDV抗體、IL-4、IL-18以及腸道灌洗液中IgA含量。同時免疫保護試驗結(jié)果顯示:重組沙門菌χ11218(pYA4545-F)和χ11218(pYA4545-F-IL18)能對基因Ⅶ型ND具有一定免疫保護效果。病理切片結(jié)果顯示χ11218(pYA4545-F)組、χ11218(pYA4545-F-IL18)組雖沒有滅活疫苗組保護效果好但與生理鹽水組和χ11218(pYA4545)組相比胸腺組織和肺組織病理變化較輕。以上結(jié)果說明了重組沙門菌具有較好的保護作用,為以延遲裂解性沙門菌作為ND疫苗活載體提供了理論依據(jù),為新城疫DNA疫苗的提供了新思路。
【圖文】：

圖 1.1: 質(zhì)粒 pYA4545-F 和 pYA4545-F-IL18 的質(zhì)粒圖譜Fig.1.1: Plasmid maps of pYA4545-F and pYA4545-F-IL181.2.2 攜帶 Flag 標簽的 pUC-F-opt 基因的擴增

1.1 pUC-F-opt 基因片段擴增結(jié)果子質(zhì)量標準；1 ：pUC-F-opt 基因片.1 Amplification of pUC-F-opt genes Marker ； 1： Product for pUC-F-o
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 沙萬里;宋泰;尹柏雙;王奔;宋永利;閆滿;宮宇宏;;新城疫病毒F-HN基因DNA疫苗的免疫效果評價[J];吉林農(nóng)業(yè)科技學院學報;2014年01期

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本文編號：2633951