【摘要】：隨著我國寵物行業(yè)的快速發(fā)展,腫瘤性疾病成為威脅寵物生命的主要原因之一,腫瘤作為犬貓的常見病與多發(fā)病,其發(fā)病幾率呈逐年上升的趨勢。人和動物在日常生活中接觸的致癌劑中有60%會導(dǎo)致肝癌。大多數(shù)致癌物質(zhì)通過誘導(dǎo)DNA損傷,促進腫瘤細胞的增殖發(fā)揮致癌作用,因此抑制癌細胞增殖是治療癌癥的重點。黃芪作為中藥中補益藥的代表,在中國已經(jīng)有上千年的藥用歷史�，F(xiàn)代藥理學(xué)表明,黃芪含皂苷類、黃酮、多糖、氨基酸和多種微量元素,具有保肝、抗腫瘤、清除自由基(抗氧化)、修復(fù)DNA損傷的作用。黃芪注射液(Astragalus injection,AI)是由黃芪提取物為主要成分的藥物,臨床上廣泛用于心氣虛損、血脈淤阻之病如心肌炎,心功能不全脾虛濕因之肝炎等疾病。近幾年來,許多研究結(jié)果表明黃芪的有效成分對多種類型的癌細胞系具有抑制增殖,促進凋亡,阻滯細胞周期的作用,但黃芪注射液對體內(nèi)肝癌是否有同樣的作用尚未確認(rèn),特別是對體內(nèi)肝癌細胞增殖活性的作用機制尚未系統(tǒng)的研究過。本試驗中,使用遺傳毒性致癌物N-二乙基亞硝胺(N-diethylnitrosamine,DEN)作為啟動劑,胡椒基丁醚(Piperonyl butoxite,PBO)和N-亞硝基嗎啉(Nnitrosomorpholine,NMOR)分別作為早期肝癌和中晚期肝癌建模中的促進劑,建立了不同時期的肝癌模型,并進行了黃芪注射液的抗癌藥效試驗。首先確認(rèn)了黃芪注射液對不同時期肝癌的抑制作用。其次,從細胞周期和細胞凋亡相關(guān)信號通路兩方面入手,在mRNA和蛋白水平上檢測黃芪注射液對肝癌細胞增殖活性的影響,并分析了它的抗癌分子機制。具體實驗結(jié)果如下:1.利用短期致癌模型的黃芪注射液對早期肝癌不同階段的影響及機制研究使用DEN和PBO建立兩階段早期肝癌模型。大鼠共分為四組:1組,DEN單獨組;2組,DEN+PBO組;3組,DEN+PBO+AI-EPI(early postinitiation,啟動階段)組;4組,DEN+PBO+AI-LPI(late postinitiation,促進階段)組。實驗開始時,所有大鼠腹腔注射200 mg/kg DEN一次,第3周開始,除DEN單獨組外其余三組開始飼喂含0.5%的PBO粉末飼料,共8周。后兩組分別在啟動階段的2周和促進階段的8周腹腔注射5 mL/kg/day的黃芪注射液。結(jié)果,與DEN單獨組相比,DEN+PBO組中大鼠肝癌癌前病灶生物標(biāo)記物胎盤型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase placental form,GST-P)陽性灶的數(shù)量和面積明顯增加。與DEN+PBO組相比,DEN+PBO+AI-EPI組的GST-P陽性灶的數(shù)量和面積沒有明顯變化,但是在DEN+PBO+AI-LPI組有明顯的減少趨勢。在細胞增殖活性生物標(biāo)記物Ki67免疫染色中,DEN+PBO組的Ki67陽性細胞率顯著高于DEN單獨組,但是與DEN+PBO組相比,給予AI的兩組的Ki67陽性細胞率顯著減少�；虮磉_分析結(jié)果顯示,與DEN+PBO組相比,AI的促進階段處理可顯著增加Ccne1,Cdkn1b,Rb1,Bax,Bcl-2,Casp3和Casp9的表達量;然而,啟動階段的AI處理沒有改變這些基因的表達量。這些結(jié)果表明,促進階段的AI處理在低劑量PBO促進的早期肝癌有微弱的抑制作用,其機制主要是通過誘導(dǎo)抑制細胞周期基因及凋亡相關(guān)基因的高表達,引起細胞周期G1/S期阻滯和凋亡。此外,啟動階段的AI處理對低劑量PBO促進的肝癌沒有影響。2.利用兩階段致癌模型的黃芪注射液對中晚期肝癌的治療效果及機制研究使用DEN和NMOR建立了大鼠中晚期肝癌模型,并將建模后的動物分為DEN+NMOR組(模型組)和DEN+NMOR+AI組(給藥組)。另外,還設(shè)立了沒有處理的對照組。實驗開始時,模型組和給藥組的大鼠腹腔注射200 mg/kg DEN后灌胃80 ppm NMOR 17周。18周開始為給藥組大鼠腹腔注射5 mL/kg/day黃芪注射液6周,模型組不進行任何處理。實驗結(jié)束后處死所有生存動物,并大體解剖,對肝、肺、脾,腎、心進行稱重。實驗結(jié)果顯示,模型組與給藥組在實驗結(jié)束后的生存率分別為55%和73%。模型組及給藥組的體重均極顯著的低于對照組,且給藥組體重顯著低于模型組。與對照組相比,模型組和給藥組的相對肺重量均顯著增加,絕對腎重量和絕對心重量顯著減少。與模型組相比,給藥組的相對肺重量顯著增加,腎和心的絕對重量顯著減少。病理學(xué)檢查結(jié)果表明,模型組和給藥組的肝癌發(fā)生率都是91%,肝腺瘤發(fā)生率分別為63%和54%,無統(tǒng)計學(xué)差異。肝癌轉(zhuǎn)移灶主要在肺,兩組的轉(zhuǎn)移率無顯著差異。另外,兩組大鼠的病理組織學(xué)檢查還發(fā)現(xiàn)肝臟膽管增生,肺腺瘤,脾髓外造血亢進等病理變化。免疫組織學(xué)檢查結(jié)果顯示,給藥組的Ki67陽性細胞率與模型組相比顯著降低,且有統(tǒng)計學(xué)差異。GST-P陽性病灶的數(shù)量和面積以及凋亡染色的陽性細胞率在模型組和給藥組之間沒有顯著差異�；虮磉_分析結(jié)果顯示,在早期實驗中顯著增加的Casp3,Rb1,p21和Cdkn1b的mRNA表達量與模型組相比在給藥組仍保持高水平。這些結(jié)果表明,黃芪注射液通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯和促進凋亡信號通路的激活,在一定時間內(nèi)可以延長大鼠的生存時間,但是不能抑制肝癌的轉(zhuǎn)移。綜上所述,黃芪注射液雖然不能有效抑制大鼠肝癌的轉(zhuǎn)移,但是對不同時期的肝癌均具有一定程度的抑制細胞增殖活性作用,且這種抑制作用有助于黃芪注射液的抗癌,特別是在早期肝癌的促進階段更為明顯。具體機制為,黃芪注射液通過G1/S期阻滯和caspase-9/3途徑激活抑制細胞增殖活性并誘導(dǎo)細胞凋亡,從而抑制肝癌的發(fā)展。本實驗為了模擬臨床,用致癌物誘導(dǎo)肝癌建立動物模型進行了抗癌實驗,并確認(rèn)了黃芪注射液的抗癌作用。這些結(jié)果不僅為動物及人類的癌癥治療提供了重要的科學(xué)依據(jù),并且為天然抗癌藥的抗癌機制的研究與發(fā)展提供了重要的理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 3.1 實驗設(shè)計圖Figure 3.1 Experimental design2.1.2 大鼠 2/3 肝臟切除手術(shù)首先使用乙醚對大鼠進行深度吸入麻醉。其次，手術(shù)部位進行消毒后剪開皮膚和腹部肌層擠出肝臟，用結(jié)扎線結(jié)扎好肝臟的中間葉和外側(cè)左葉，并剪去該葉，確認(rèn)切除部不出血后進行縫合，最后用碘伏消毒手術(shù)部位。實驗結(jié)束后，積極關(guān)注大鼠狀態(tài)。2.2 肝臟樣品的采集及處理動物實驗結(jié)束后，對大鼠進行乙醚麻醉，腹主動脈放血處死，取下肝臟。肉眼觀察大鼠肝臟，記錄病變。稱量肝重，計算每只動物的肝臟的臟體系數(shù)：肝臟臟體系數(shù)（g/100g）= 肝臟絕對重量 /（大鼠剖前體重×100）對取出的肝臟后，分離外側(cè)右葉和右葉尾部，各取材 2 段，每段 0.5 cm 左右厚度，分兩份置于標(biāo)記好的包埋盒中，標(biāo)本置于 10% 福爾馬林緩沖液中固定保存，

P <0.01 為差異極顯著。“*”或“**”表示與 DEN 單獨組相比性，“#”或“# #”表示與模型組相比的顯著性。果床狀態(tài)，體重及肝重整個實驗過程中，所有大鼠未發(fā)現(xiàn)異常，僅三只大鼠由于肝切除術(shù)死亡。飼O 粉末飼料的大鼠從第 2 周到實驗結(jié)束，體重增加受到抑制（圖 3.2）。PBO+AI-LPI組的最終體重與 DEN+PBO 組相比明顯下降，但 DEN+PBO+AI-未見明顯變化。在肝重量中，與 DEN 單獨組相比，飼喂 PBO 的三組大鼠的重量均極顯著增加（表 3.1）。但 DEN+PBO+AI-LPI 組的絕對和相對肝重量 DEN+PBO 組，且其絕對肝重量與 DEN+PBO 組相比有顯著差異。相反，，PBO+AI-EPI 組的絕對和相對肝重均相比 DEN+PBO 組有所上升，但無統(tǒng)計。實驗全程各組的攝食量之間沒有顯著差異（圖 3.3）。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S853.7

【參考文獻】

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本文編號：2631284