【摘要】：抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運體(Transporter associated with antigen processing,TAP)是主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex,MHC)I類分子抗原遞呈途徑中的關(guān)鍵蛋白。本研究利用TAP單倍型無特定病原體(Specific pathogen free,SPF)鴨,分別通過鴨瘟標(biāo)準(zhǔn)強毒和弱毒疫苗接種試驗,分析Tap多態(tài)性對鴨瘟致病性和免疫應(yīng)答能力的影響。本研究首先優(yōu)化了國家禽類實驗動物種子中心培育的HBK-SPF鴨3個TAP單倍型鴨的遺傳學(xué)檢測方法。經(jīng)過對HBK-SPF種鴨Tap2基因組序列的多態(tài)性分析,確定Tap2基因前663 nt為遺傳學(xué)檢測區(qū)域。在此基礎(chǔ)上建立了Tap2基因分型PCR檢測方法,對現(xiàn)存F3代B2、B3和B4系鴨進行遺傳學(xué)穩(wěn)定性檢測。結(jié)果顯示,B2和B4系鴨與F0代基因型完全一致,但B3鴨群內(nèi)出現(xiàn)2種基因型,表明在育種過程中曾發(fā)生過一次遺傳學(xué)污染。利用HBK-SPF鴨B2系TAP蛋白肽結(jié)合區(qū)的大腸桿菌表達產(chǎn)物制備了特異性單抗1A6。截短表達法初步鑒定單抗針對的抗原表位位于TAP2蛋白~(297)NARHQMLQQAVLDATAGTGMVVQEAI~(322)。利用1A6對鴨外周血淋巴細胞進行間接免疫熒光試驗,結(jié)果為陽性。對SPF白來航雞、鴨、SPF長白豬、常規(guī)鵪鶉和鵝的十二指腸石蠟切片進行免疫組織化學(xué)檢測,結(jié)果在雞和鴨腸粘膜固有層檢測到大量特異性信號,對鵝、豬和鵪鶉顯示陰性。利用1A6對鴨瘟疫苗免疫-攻毒鴨的腸黏膜細胞進行透射電鏡檢測,在細胞核核膜上清晰看到特異性免疫金顆粒。利用鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)標(biāo)準(zhǔn)強毒株CSC對7日齡B2、B3、B4以及第2代封閉群SPF金定鴨(JD)進行感染試驗。結(jié)果B3系鴨2 dpi出現(xiàn)死亡,比JD鴨早2 d,死亡鴨盲腸中DEV UL6基因的拷貝數(shù)、十二指腸中MHC I類分子、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的平均轉(zhuǎn)錄水平,以及哈德氏腺中IgA的含量均高于其它3個品系。利用鴨瘟弱毒活疫苗(K-CKCE株)接種7日齡B2、B3、B4和JD鴨。結(jié)果表明,接種前和接種后14 d的B2、B3和B4鴨都能通過免疫組化在腸道粘膜檢測到TAP蛋白,而JD鴨免疫14 d后方能達到檢測閾值;14和28 d時,B3鴨盲腸中DEV的拷貝數(shù)最低,而JD最高;B2系鴨28 d仍能從哈德氏腺和膽汁中檢測到高表達的IgA,始終高于其他組,MHC I、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平上升最快,CD4~+/CD8~+細胞的比值同JD鴨正相反,其它品系鴨的MHC I、IFN-α、IFN-β和IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降。上述研究表明,TAP單倍型紹興麻鴨(HBK-SPF)與封閉群金定麻鴨(JD-SPF)在對鴨瘟強毒和疫苗接種表現(xiàn)出不同的免疫應(yīng)答能力,B3系對強毒感染敏感,而B2系對疫苗接種應(yīng)答能力更強。本研究為選育疫病易感型SPF鴨提供了依據(jù)。
【圖文】：

黑色下劃線表示跨膜區(qū)；大方框表示肽結(jié)合區(qū)；小方框表示 B3 特異性位點Black underline is transmembrane domain; Big box is peptide binding domain; Small box is B3 specific圖2.1Tap1 基因型鴨Tap2 編碼區(qū)序列氨基酸分析Fig. 2.1 Amino acid sequence analysis of Tap1 genotype SPF duck Tap2 CDS

3 代 B 系列鴨 Tap2 基因擴增結(jié)果 37 羽第 3 代 Tap2 基因型 B 系列鴨外周血細胞基因組 DNA 為模板進行 PCR 擴行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果得到大小符合的單一條帶，，與目的片 663 bp 的理性對照沒有條帶。部分個體的 PCR 電泳結(jié)果見圖 2.2。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15黑色下劃線表示跨膜區(qū)；大方框表示肽結(jié)合區(qū)；小方框表示 B3 特異性位點Black underline is transmembrane domain; Big box is peptide binding domain; Small box is B3 specific圖2.1Tap1 基因型鴨Tap2 編碼區(qū)序列氨基酸分析Fig. 2.1 Amino acid sequence analysis of Tap1 genotype SPF duck Tap2 CDS
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.32

【參考文獻】

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本文編號：2630819