【摘要】：牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)與豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),綿羊邊界病毒(Border disease virus,BDV)等同屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員,在血清上有交叉反應(yīng)。該病毒感染能引起牛病毒性—粘膜病(BVD-MD),免疫耐受,孕牛流產(chǎn)或胎兒畸形等。BVDV除了感染牛以外,還可以感染豬、羊、駱駝等40多種動物,并引起發(fā)病。持續(xù)性感染(Persistant infection,PI)的牛終生帶毒、排毒,促進了本病毒的傳播。BVDV給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失,根據(jù)病毒感染細胞能否產(chǎn)生細胞病變將BVDV分成致細胞病變型BVDV(Cytopathic BVDV,CP-BVDV)和非致細胞病變型BVDV(NoncytopathicBVDV,NCP-BVDV),PI牛主要是由于NCP-BVDV感染所致。BVDV防控依賴于有效的快速診斷方法進行監(jiān)測,安全高效的疫苗進行預(yù)防和有效的抗病毒藥物進行治療。目前我國仍然缺乏自主研發(fā)的BVDV快速檢測技術(shù),NCP-BVDV不能產(chǎn)生細胞病變,不能采用常規(guī)的方法測定病毒滴度,這極大限制了抗病毒藥物的篩選。本研究的終極目標是建立BVDV抗原和/或抗體檢測試紙,并建立針對NCP-BVDV的滴度測定方法而建立抗病毒藥物篩選方法。本研究首先利用切向流過濾和瓊脂糖凝膠分子篩Sepherose 4 Fast Flow對病毒NCP-BVDV進行純化,通過免疫BALB/C小鼠制備了針對抗BVDV的單克隆抗體。獲得5株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為9G6D6、14G5F2、19A3H8、28H11G4、31D11C11。免疫染色方法測得腹水抗體的效價分別為1.28X 105、1.28X 105、1.02×106、1.28X 105、3.2×103。5株單克隆抗體的輕鏈亞型均為Kappa,重鏈均為lgGl。5株單抗均不與CSFV產(chǎn)生交叉反應(yīng)。19A3H8具有中和反應(yīng)活性,中和效價為1:6400。試圖用5株單抗進行抗原試紙條的制備,但效果均不理想。為了建立高效簡單的用于NCP-BVDV抗病毒藥物的篩選方法,本研究利用上述單抗,建立了免疫染色的方法。通過利用免疫染色方法和熒光定量PCR對兩種已知抗BVDV藥物Ribavirin、Ammonium Chloride進行試驗,證明了免疫染色方法的有效性,另外利用該方法研究發(fā)現(xiàn)PLC抑制劑U73122也影響NCP-BVDV復制。為了制備具有生物學活性的BVDVEms蛋白,我們采用兩種策略:將N端部分氨基酸進行原核表達和對BVDV Ems全長進行真核表達。將BVDV N-末端Ems基因克隆到原核表達載體pET-28a上,構(gòu)建pETT-28a-N-Erns重組質(zhì)粒,在BL21(DE3)pLysS細菌中,經(jīng)IPTG誘導表達,蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)變復性后,作為抗原包板,ELISA檢測,與BVDV陽性血清有較好的反應(yīng),說明原核表達的BVDVN-末端Erns有較好的生物學活性(反應(yīng)原性)。將BVDV Erns E2基因克隆連接到真核載體pEGFP-Nl,構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Ems和pEGFP-Nl-E2轉(zhuǎn)染入293T細胞中,發(fā)現(xiàn)只有Erns能夠成功表達。綜上所述,本研究制備了針對BVDV的單克隆抗體,并建立了一種簡單可靠的方法用于測定NCP-BVDV滴度及用于抗病毒藥物篩選,易于在生產(chǎn)和科研中推廣和應(yīng)用。并且成功的原核表達出了 BVDVN-末端Erns蛋白,以及真核表達出了 BVDVEms蛋白。原核表達的抗原Erns片段具有生物學活性,對后續(xù)ELISA抗體檢測試劑盒的研究奠定基礎(chǔ),Ems真核表達的成功為后續(xù)針對Erns的單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

３．２．１對ＢＶＤＶ純化前后進行病毒滴度的測定逡逑將純化前ＢＶＤＶ上清、純化后收集的第一個峰物質(zhì)以及純化后收集的第二個峰物質(zhì)進逡逑行ＴＣＩＤ５（）的測定，由圖１－２可知，純化后的病毒是在第一個峰收集的，，且病毒滴度升高了。逡逑

ｌ：Ｖｉｒｕｓ邋ｓｔｏｃｋｓ；邋２：Ｐｅａｋ邋１邋ｂｙ邋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ邋４ＦＦ；邋３：Ｐｅａｋ邋２邋ｂｙ邋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ邋４ＦＦ逡逑３．２．２免疫染色測定ＢＶＤＶ活性逡逑免疫染色對純化前后的ＢＶＤＶ進行了活性鑒定，從圖１－３可知，純化后的ＢＶＤＶ依逡逑舊具有很好感染ＭＤＢ１Ｃ細胞的能力。逡逑■■■■■■■■■■■■■Ｉ逡逑Ａ邐ｎ邐Ｂ逡逑一邋，逡逑圖１－３切向流膜包與瓊脂糖凝膠分子篩純化后的病毒活性鑒定逡逑Ａ：純化后ＢＶＤＶ感染ＭＤＢＫ；邋Ｂ：未感染ＢＶＤＶ的ＭＤＢＫ細胞逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ＴＦＦ－ＳＥＣ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｖｉｒｕｓ逡逑Ａ：邋ＭＤＢＫ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＴＦＦ－ＳＥＣ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＢＶＤＶ；逡逑Ｂ：邋ＭＤＢＫ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｍｏｃｋ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王建昌;王金鳳;崔元;劉立兵;袁萬哲;;BVDV一步法雙重熒光RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J];中國獸醫(yī)學報;2018年02期

2 李玉賾;張連學;姚允怡;齊憲輝;郜玉鋼;;人參皂苷抗梅花鹿源BVDV研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2011年23期

3 謝春芳;于瑞嵩;董世娟;陳冰清;馮蒙;繆德年;李震;;上海郊區(qū)牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)基因型分析[J];上海農(nóng)業(yè)學報;2017年03期

4 程凱慧;朱彤;侯佩莉;王洪梅;苗自利;張亮;解曉莉;楊宏軍;何洪彬;;不同生物型BVDV感染宿主細胞后差異基因分析[J];中國畜牧獸醫(yī);2017年11期

5 熊慎蘇;;雜談BVDV[J];今日養(yǎng)豬業(yè);2011年03期

6 ZHANG Yong-qiang;LIU Hai-sheng;WU Xiao-dong;WANG Xiao-zhen;LI Jin-ming;ZHAO Yong-gang;Lü Yan;REN Wei-jie;GE Sheng-qiang;WANG Zhi-liang;;A novel real-time RT-PCR with TaqM an-MGB probes and its application in detecting BVDV infections in dairy farms[J];Journal of Integrative Agriculture;2015年08期

7 張倩;陶潔;張東;區(qū)炳明;林航;楊穎;張信軍;朱禮倩;王建業(yè);賀生中;孟婷;謝靜;朱國強;;國內(nèi)新型基因2型牛病毒性腹瀉病毒研究進展[J];中國動物傳染病學報;2017年01期

8 任敏;焦海宏;蔣穎;劉振華;王傳彬;朱國強;;基因2型牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法的建立和初步應(yīng)用[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學報;2008年09期

9 宋永峰;張志;張燕霞;吳發(fā)興;李曉成;;豬源牛病毒性腹瀉病毒的流行初探[J];中國動物檢疫;2008年07期

10 鄧宇;王新華;郭燕;鐘發(fā)剛;榮光;夏倫斌;陳琛;;抗BVDV卵黃抗體的制備[J];家畜生態(tài)學報;2007年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 羅海峰;;BVDV and BVDV Ag POC牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)防控及快速檢測技術(shù)[A];第四屆全國牛病防制及產(chǎn)業(yè)發(fā)展大會論文集[C];2012年

2 武華;;牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)及綜合防制技術(shù)[A];第四屆全國牛病防制及產(chǎn)業(yè)發(fā)展大會論文集[C];2012年

3 郜玉鋼;劉佳佳;楊鶴;張連學;臧埔;;鹿源BVDV敏感中藥篩選的研究[A];現(xiàn)代化中藥制劑發(fā)展與中藥藥理學研究交流會論文集[C];2009年

4 張國奇;黃美玲;吳鵬;盛金良;陳創(chuàng)夫;;BVDV納米抗體的篩選、表達及抗病毒效果的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第二十一次學術(shù)研討會暨中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會第二十次學術(shù)研討會論文集[C];2015年

5 楊俊興;唐金明;李健波;孫潔;曹琛福;曾少靈;盧體康;呂建強;花群義;;牛病毒性腹瀉病毒雙單克隆抗體夾心ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術(shù)研討會論文集[C];2013年

6 郜玉鋼;王樹志;張連學;;魚腥草抗梅花鹿源BVDV病毒的實驗研究[A];第六屆全國藥用植物和植物藥學術(shù)研討會論文集[C];2006年

7 周玉龍;任亞超;吳丹丹;叢彥龍;尹仁福;武瑞;丁壯;;黑龍江省病毒性腹瀉病毒流行病學調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第九次全國會員代表大會暨第十七次全國學術(shù)研討會論文集[C];2017年

8 王國超;王滬生;喬軍;孟慶玲;劉昱成;楊海波;賀志昊;陳創(chuàng)夫;;新疆BVDV基因2型毒株的分離與鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2013年學術(shù)年會論文集[C];2013年

9 黃凱;張俊杰;劉英霞;齊長明;邵小磊;馬宏磊;馬

本文編號：2629077