發(fā)布時(shí)間：2020-04-15 22:50

【摘要】：牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)與豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),綿羊邊界病毒(Border disease virus,BDV)等同屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員,在血清上有交叉反應(yīng)。該病毒感染能引起牛病毒性—粘膜病(BVD-MD),免疫耐受,孕牛流產(chǎn)或胎兒畸形等。BVDV除了感染牛以外,還可以感染豬、羊、駱駝等40多種動(dòng)物,并引起發(fā)病。持續(xù)性感染(Persistant infection,PI)的牛終生帶毒、排毒,促進(jìn)了本病毒的傳播。BVDV給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失,根據(jù)病毒感染細(xì)胞能否產(chǎn)生細(xì)胞病變將BVDV分成致細(xì)胞病變型BVDV(Cytopathic BVDV,CP-BVDV)和非致細(xì)胞病變型BVDV(NoncytopathicBVDV,NCP-BVDV),PI牛主要是由于NCP-BVDV感染所致。BVDV防控依賴于有效的快速診斷方法進(jìn)行監(jiān)測(cè),安全高效的疫苗進(jìn)行預(yù)防和有效的抗病毒藥物進(jìn)行治療。目前我國(guó)仍然缺乏自主研發(fā)的BVDV快速檢測(cè)技術(shù),NCP-BVDV不能產(chǎn)生細(xì)胞病變,不能采用常規(guī)的方法測(cè)定病毒滴度,這極大限制了抗病毒藥物的篩選。本研究的終極目標(biāo)是建立BVDV抗原和/或抗體檢測(cè)試紙,并建立針對(duì)NCP-BVDV的滴度測(cè)定方法而建立抗病毒藥物篩選方法。本研究首先利用切向流過(guò)濾和瓊脂糖凝膠分子篩Sepherose 4 Fast Flow對(duì)病毒NCP-BVDV進(jìn)行純化,通過(guò)免疫BALB/C小鼠制備了針對(duì)抗BVDV的單克隆抗體。獲得5株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為9G6D6、14G5F2、19A3H8、28H11G4、31D11C11。免疫染色方法測(cè)得腹水抗體的效價(jià)分別為1.28X 105、1.28X 105、1.02×106、1.28X 105、3.2×103。5株單克隆抗體的輕鏈亞型均為Kappa,重鏈均為lgGl。5株單抗均不與CSFV產(chǎn)生交叉反應(yīng)。19A3H8具有中和反應(yīng)活性,中和效價(jià)為1:6400。試圖用5株單抗進(jìn)行抗原試紙條的制備,但效果均不理想。為了建立高效簡(jiǎn)單的用于NCP-BVDV抗病毒藥物的篩選方法,本研究利用上述單抗,建立了免疫染色的方法。通過(guò)利用免疫染色方法和熒光定量PCR對(duì)兩種已知抗BVDV藥物Ribavirin、Ammonium Chloride進(jìn)行試驗(yàn),證明了免疫染色方法的有效性,另外利用該方法研究發(fā)現(xiàn)PLC抑制劑U73122也影響NCP-BVDV復(fù)制。為了制備具有生物學(xué)活性的BVDVEms蛋白,我們采用兩種策略:將N端部分氨基酸進(jìn)行原核表達(dá)和對(duì)BVDV Ems全長(zhǎng)進(jìn)行真核表達(dá)。將BVDV N-末端Ems基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a上,構(gòu)建pETT-28a-N-Erns重組質(zhì)粒,在BL21(DE3)pLysS細(xì)菌中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)變復(fù)性后,作為抗原包板,ELISA檢測(cè),與BVDV陽(yáng)性血清有較好的反應(yīng),說(shuō)明原核表達(dá)的BVDVN-末端Erns有較好的生物學(xué)活性(反應(yīng)原性)。將BVDV Erns E2基因克隆連接到真核載體pEGFP-Nl,構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Ems和pEGFP-Nl-E2轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)只有Erns能夠成功表達(dá)。綜上所述,本研究制備了針對(duì)BVDV的單克隆抗體,并建立了一種簡(jiǎn)單可靠的方法用于測(cè)定NCP-BVDV滴度及用于抗病毒藥物篩選,易于在生產(chǎn)和科研中推廣和應(yīng)用。并且成功的原核表達(dá)出了 BVDVN-末端Erns蛋白,以及真核表達(dá)出了 BVDVEms蛋白。原核表達(dá)的抗原Erns片段具有生物學(xué)活性,對(duì)后續(xù)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研究奠定基礎(chǔ),Ems真核表達(dá)的成功為后續(xù)針對(duì)Erns的單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

３．２．１對(duì)ＢＶＤＶ純化前后進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定逡逑將純化前ＢＶＤＶ上清、純化后收集的第一個(gè)峰物質(zhì)以及純化后收集的第二個(gè)峰物質(zhì)進(jìn)逡逑行ＴＣＩＤ５（）的測(cè)定，由圖１－２可知，純化后的病毒是在第一個(gè)峰收集的，，且病毒滴度升高了。逡逑

ｌ：Ｖｉｒｕｓ邋ｓｔｏｃｋｓ；邋２：Ｐｅａｋ邋１邋ｂｙ邋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ邋４ＦＦ；邋３：Ｐｅａｋ邋２邋ｂｙ邋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ邋４ＦＦ逡逑３．２．２免疫染色測(cè)定ＢＶＤＶ活性逡逑免疫染色對(duì)純化前后的ＢＶＤＶ進(jìn)行了活性鑒定，從圖１－３可知，純化后的ＢＶＤＶ依逡逑舊具有很好感染ＭＤＢ１Ｃ細(xì)胞的能力。逡逑■■■■■■■■■■■■■Ｉ逡逑Ａ邐ｎ邐Ｂ逡逑一邋，逡逑圖１－３切向流膜包與瓊脂糖凝膠分子篩純化后的病毒活性鑒定逡逑Ａ：純化后ＢＶＤＶ感染ＭＤＢＫ；邋Ｂ：未感染ＢＶＤＶ的ＭＤＢＫ細(xì)胞逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ＴＦＦ－ＳＥＣ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｖｉｒｕｓ逡逑Ａ：邋ＭＤＢＫ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＴＦＦ－ＳＥＣ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＢＶＤＶ；逡逑Ｂ：邋ＭＤＢＫ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｍｏｃｋ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2629077