【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(Procine epidemic diaherra virus,PEDV)屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬,是一種單股正鏈RNA病毒,能夠引起豬流行性腹瀉(Procine epidemic diaherra,PED)。1971年PEDV發(fā)現(xiàn)于歐洲,1978年比利時分離到經(jīng)典毒株CV777。2010年新出現(xiàn)的PEDV突變株引起仔豬急性水樣腹瀉,病死率高達80%~100%,給世界和我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。microRNAs(miRNAs)是一類多功能的小RNA,一些miRNAs在病毒的感染過程中通過調(diào)控宿主的天然免疫而發(fā)揮抗病毒作用。本文分離鑒定了一株PEDV毒株,進行了PEDV感染豬小腸上皮細胞(swine intestinal epithelial cells,SIEC)的miRNAs組學分析,然后重點研究了miR-221-5p和miR-615對PEDV復制過程的影響及機制,獲得了以下結果:1.PEDV區(qū)域流行毒株的分離鑒定和全基因序列的分析本研究從臨床PEDV陽性病料中分離到了一株PEDV毒株,進行了全基因組測序和分析,結果顯示,病毒基因組全長28063 nt,包括5’(300 nt)和3’(500 nt)的非翻譯區(qū);全基因組進化分析發(fā)現(xiàn),該毒株屬于G2流行毒株組,與近年分離的毒株親緣關系最近;該毒株S基因沒有出現(xiàn)插入和刪除,ORF3基因也沒有發(fā)生缺失。將分離鑒定的PEDV毒株命名為CH/HBTS/2017。2.PEDV感染的SIEC miRNAs組學分析(1)用疫苗毒株CV777和ORF3缺失的強毒株NW17感染SIEC后,應用高通量測序方法鑒定miRNAs的表達差異。結果顯示,不同毒力的PEDV毒株感染SIEC后均改變了細胞miRNAs的表達譜。共鑒定了229個miRNAs成熟體和232個前體。表達分析表明,CV777 vs.Mock有102個差異miRNAs,NW17 vs.Mock組有97個差異miRNAs,其中有78個miRNAs在這兩組差異基因中同時出現(xiàn)。(2)對差異的miRNAs進行靶基因預測,并將靶基因進行GO和KEEG分析,結果顯示NF-κB、MAPK、TLR等信號通路參與了PEDV感染的過程,進一步分析發(fā)現(xiàn)NF-κB通路具有最高的富集分數(shù)。3.miR-221-5p通過靶向病毒基因組和激活NF-κB通路抑制病毒的復制(1)應用ViTa數(shù)據(jù)庫預測靶向病毒基因組的miRNAs,發(fā)現(xiàn)miR-221-5p同時靶向30個PEDV毒株3’端最保守的區(qū)域。利用miR-221-5p模擬物,轉染SIEC、Vero和Marc-145細胞后都可以抑制PEDV復制,并且在Marc-145細胞中的抑制作用最強。(2)發(fā)現(xiàn)miR-221-5p可以與病毒3’UTR靶標區(qū)域結合。與天然免疫缺陷的Vero細胞相比,miR-221-5p在Marc-145細胞中發(fā)揮更強的抑制PEDV復制的作用。上調(diào)IFN-α、IFN-β和干擾素刺激基因ISG15的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn),miR-221-5p主要通過影響NF-κB通路發(fā)揮作用,證明NF-κB的啟動子被激活;確認p65的核轉位增加,進一步探明p65的入核是由于IκB的減少所致。(3)用Targetscan程序進一步預測了miR-221-5p的靶基因,篩選了5個在NF-κB通路的靶基因,雙熒光素酶報告基因試驗顯示,miR-221-5p可以與SOCS1和NFKBIA基因結合,并且下調(diào)了這兩個蛋白的表達。通過對SOCS1和NF-κB的敲低和過表達發(fā)現(xiàn),SOCS1和NFKBIA可以在PEDV感染時抑制NF-κB通路,進一步探明miR-221-5p通過下調(diào)這兩個負調(diào)控因子來激活NF-κB通路。4.miR-615通過靶向IRAK1調(diào)控Ⅲ型干擾素(IFN-Ⅲ)的表達來促進病毒復制(1)高通量測序的數(shù)據(jù)顯示,在PEDV感染的SIEC細胞中miR-615下調(diào)。過表達miR-615可以促進PEDV在SIEC細胞中的復制,而敲低miR-615可以抑制PEDV在SIEC細胞中的復制。(2)過表達miR-615,Ⅰ型干擾素和Ⅲ型干擾素都被下調(diào),其中,IFN-λ1和IFN-λ3下調(diào)更明顯。(3)用miRanda、RNAhybrid和PITA3個數(shù)據(jù)庫的預測miR-615的靶基因發(fā)現(xiàn),IRAK1是miR-615的靶基因。雙熒光素酶報告基因試驗證明miR-615可以結合IRAK1靶基因區(qū)域。敲低IRAK1后,IFN-λ1和IFN-λ3的表達下降;過表達IRAK1后,IFN-λ1和IFN-λ3轉錄水平表達上調(diào)。并且,miR-615可以下調(diào)IRAK1的蛋白水平。將miR-615與IRAK1共轉染,結果顯示,IRAK1逆轉了miR-615轉染引起的IFN-λ1和IFN-λ3的下調(diào)和病毒復制的增加。綜上所述,分離到了一株PEDV毒株;PEDV感染SIEC的過程中改變了miRNAs的表達譜。miR-221-5p通過調(diào)控IκB和SOCS1蛋白激活了NF-κB通路,從而抑制PEDV復制;miR-615通過調(diào)控IRAK1抑制了NF-κB的激活,從而促進PEDV的復制,說明NF-κB通路在PEDV感染過程中起了重要作用。本研究揭示了miRNAs可以通過調(diào)控天然免疫通路來影響PEDV復制,為闡明PEDV致病機理提供了新的科學資料。
【圖文】：

圖 1-1 基于 CV777 株基因的 PEDV 基因組示意圖(引自 Song and Park 2012)-1 Schematic representation of the PEDV genome based on the CV777(From Song and ParkEDV 流行病學亞洲，豬流行性腹瀉（PED）最早于 1982 年發(fā)生在日本，從那以后，PE洲國家引起了嚴重的流行病，特別是在中國和韓國 (Jinghui and Yijing 2002015; Takahashi et al. 1983)。在 20 世紀末，PEDV 在菲律賓、泰國、臺灣和

NAs 的生物合成過程示意圖(引自 Gurtan and Shar miRNAs biogenesis pathway(From Gurtan and Sha的加工可以加載到由 Dicer、TRBP 和 Argo et al. 2005; Maniataki and Mourelatos 2005)。As所必需的，但其在復合物中的存在使得能體底物。在某些情況下，，Ago 對含有良好配的活性。在哺乳動物細胞中，已顯示 Ago2 o2 切割的前體 miRNAs（ac-pre-miRNAs）(長度的人工 pre-miRNAs 也被 Ago2 有效切通過 Ago2 進行加工(Cifuentes et al. 2010; Y的 21～24 nt 大小的 miRNAs 雙鏈體后 miRNAs 誘導的沉默復合物（miRISC）。關輔因子以指導靶向 mRNA，導致 mRNe 2011; Pasquinelli 2012)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28

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本文編號：2626947