延黃牛脂肪細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)及相關(guān)功能基因?qū)Τ芍只饔玫难芯?/H1>
發(fā)布時間：2020-04-12 17:36
【摘要】：牛肉以高蛋白、高不飽和脂肪酸含量等優(yōu)良品質(zhì)越來越多的受到消費者的喜愛。隨著物質(zhì)基礎(chǔ)和生活質(zhì)量的提高,消費者對肉質(zhì)鮮美、口感鮮嫩多汁、大理石花紋多的牛肉的需求日益增多。肌內(nèi)脂肪沉積是一個涉及了脂肪生成、脂肪降解及脂肪酸轉(zhuǎn)運的動態(tài)平衡過程,一旦合成代謝的能力大于分解代謝時候,脂肪沉積增加,而當(dāng)原始平衡破壞時脂肪沉積則減少。牛肉肌內(nèi)脂肪的沉積及分布受到如品種、飼養(yǎng)條件、飼料成分等諸多因素的影響,因此利用分子生物學(xué)技術(shù)從根本上提高胴體質(zhì)量促進脂肪沉積是一種行之有效的途徑。市場上雖然有一些被廣泛應(yīng)用的商品化細胞系,但因其具有種屬特異性而無法真實地反映出牛等大型家畜的脂肪合成和代謝的實際調(diào)控過程。為了更加深入了解延黃牛脂肪細胞的生物學(xué)特性及潛在的分化機制,本研究在分離脂肪前體細胞的基礎(chǔ)上,建立了體外誘導(dǎo)分化體系,利用RNA-Seq技術(shù)對不同分化階段脂肪細胞進行轉(zhuǎn)錄本測序,對篩選獲得的候選基因進行了生物信息學(xué)分析和體外驗證,深入研究了 HTR2A和TRIB3在成脂分化過程中的作用,為進一步研究牛脂肪沉積作用機制和分子育種奠定了基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1.利用膠原酶消化法分離了延黃牛前體脂肪細胞,并進行了原代和傳代培養(yǎng);用傳統(tǒng)的雞尾酒法對前體脂肪細胞添加了多種誘導(dǎo)因子對其進行誘導(dǎo)分化,對脂肪細胞進行鑒定。結(jié)果顯示:(1)本研究成功分離了延黃牛前體脂肪細胞;(2)細胞生長狀態(tài)良好,符合正常的細胞生長規(guī)律;(3)經(jīng)誘導(dǎo)分化后的細胞可被油紅O染色,呈現(xiàn)典型的圓形脂滴,具有成熟脂肪細胞的典型特征;(4)甘油三酯含量在早期變化緩慢,在第4天以后顯著升高;(5)成脂標(biāo)志因子PPARγ、C/EBPα隨著分化過程的進行,在分化早期顯著上升,隨著分化進程的結(jié)束略有下降。2.通過RNA-Seq技術(shù)對延黃牛脂肪細胞的分化前期、分化中期及分化末期進行了轉(zhuǎn)錄本測序,結(jié)果顯示:(1)原始測序數(shù)據(jù)在過濾后,獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù),所有這些樣品的clean reads的Q20%得分達到90%以上,不同階段的GC含量(%)皆在51%～53%范圍內(nèi);(2)在對牛不同分化階段的差異表達基因分析中,與Day-0相比,Day-4共有2510個DEGs(1277個上調(diào)基因和1233個下調(diào)基因);與Day-4相比,Day-9共有2446個差異表達基因(811個上調(diào)基因和1635個下調(diào)基因);(3)GO及KEGG分析發(fā)現(xiàn)DEGs富集在2000多個功能術(shù)語的類別和超過300個KEGG通路中,對牛不同分化階段的功能富集分析中發(fā)現(xiàn)脂肪細胞分化的早期起到最主要的作用,主要參與染色體有絲分裂等細胞周期進程,分化末期主要是細胞形態(tài)的改變,細胞信號通路的富集作用也有一定程度的減弱;(4)采用qRT-PCR的方法隨機挑選數(shù)個差異表達基因,其定量結(jié)果與RNA-seq的結(jié)果進行對比分析,qRT-PCR的定量結(jié)果與RNA-Seq的結(jié)果雖略有差異,但變化趨勢大體相同,表明RNA-seq的測序結(jié)果真實可靠。3.利用體外表達調(diào)控技術(shù)對候選成脂促進基因HTR2A的作用機制進行了研究,結(jié)果顯示:(1)HTR2A過表達組能顯著促進成熟脂肪細胞的脂滴及甘油三酯含量,促進成脂關(guān)鍵因子C/EBPα及PPARγ的表達,而HTR2A的干擾組則與其相反,脂滴及甘油三酯含量均顯著降低,抑制成脂關(guān)鍵因子C/EBPα及PPARγ的表達;(2)HTR2A過表達組能顯著促進Akt信號通路蛋白及Akt信號通路Ser473位點磷酸化蛋白的表達,促進p38 MAPK信號通路蛋白及p38 MAPK信號通路磷酸化蛋白的表達,促進ERK1/2 MAPK信號通路蛋白及ERK1/2 MAPK信號通路磷酸化蛋白的表達,推測HTR2A可能通過調(diào)控Akt信號通路、p38MAPK信號通路及ERK1/2 MAPK信號通路從而在促進成脂分化過程中起到重要的作用。4.利用體外表達調(diào)控技術(shù)對候選成脂抑制基因TRIB3的作用機制進行了研究,結(jié)果顯示:(1)TRIB3過表達組能顯著抑制成熟脂肪細胞的脂滴及甘油三酯含量,而TRIB3的干擾組則與其相反,脂滴及甘油三酯含量升高;(2)TRIB3過表達顯著抑制Akt信號通路蛋白及Akt信號通路Ser473位點磷酸化蛋白的表達,促進p38 MAPK信號通路蛋白及p38 MAPK信號通路磷酸化蛋白的表達,促進ERK1/2 MAPK信號通路蛋白及ERK1/2 MAPK信號通路磷酸化蛋白的表達來完成的,推測TRIB3可能通過調(diào)控Akt信號通路、p38 MAPK信號通路及ERK1/2 MAPK信號通路在延黃牛的抑制成脂分化過程中起到重要的作用。綜上所述,本研究成功分離了延黃牛前體脂肪細胞,在脂肪細胞分化的不同時期進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,對成脂分化過程中的功能基因HTR2A和TRIB3進行了研究,為加深對延黃牛脂肪分化的機制的理解奠定分子基礎(chǔ),也為肌內(nèi)脂肪沉積的機理提供了參考依據(jù)。
【圖文】：
２．３．１延黃牛前體脂肪細胞形態(tài)學(xué)觀察逡逑本研究采用膠原酶消化法分離細胞，在細胞接種后，多種細胞均勻懸浮在培逡逑養(yǎng)液中（圖２．１－Ａ）；用ＰＢＳ沖洗掉未貼壁的雜細胞，前體脂肪細胞輕微貼壁，之逡逑后貼壁的細胞開始逐漸生長（圖２．１－Ｂ和圖２．１－Ｃ）；隨著細胞生長時間的延長，５逡逑ｄ時細胞呈旋渦狀，，細胞生長有一定的紋路（圖２．１－Ｄ），之后由于空間及營養(yǎng)物逡逑質(zhì)的限制，呈現(xiàn)生長抑制不再進行增殖，進而退出增殖周期，在轉(zhuǎn)錄因子的刺激逡逑下啟動隨后的脂肪細胞分化程序。逡逑ＨＨＨＨ逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑？．大《＇邐七、邐，逡逑圖２．１延黃牛前體脂肪細胞的形態(tài)（１０0ｘ）逡逑Ａ：細胞接種２ｈ后形態(tài)；Ｂ：接種２ｄ后細胞形態(tài)；Ｃ：細胞接種３ｄ后形態(tài)；Ｄ：細胞接種５ｄ后形態(tài)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｙａｎ邋Ｙｅｌｌｏｗ邋ｃａｔｔｌｅ邋ｐｒｅ－ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ邋（１０0ｘ）逡逑Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｃｅｌ
邋１０００，邋＾ＯＯｐｍｏｌ邋Ｌ／１濃度及其對應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各孔的吸光值逡逑為ｙ軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為ｘ軸繪制散點圖，并添加趨勢線，顯示公式及ｉ？２值，標(biāo)逡逑準(zhǔn)曲線公式如下：Ｙ＝９Ｅ－０５ｘ－０．００６，邋Ｒ２＝０．９９５。結(jié)果如圖２．４所示，甘油三酯的逡逑含量在前４ｄ時變化緩慢，第４天開始迅速上升。在整個誘導(dǎo)分化的過程中，早逡逑期是形成脂肪細胞的過程，后期脂滴才逐漸積累。逡逑sE逡逑｜邋ｅｏｏ邐／逡逑６００邋／逡逑Ｓ邋ｍ邐／逡逑ｇ邋２００逡逑0＇邐１邐．邐．邐逡逑０邐４邐９逡逑時問（天）逡逑圖２．４誘導(dǎo)分化過程中甘油三酯含量的變化逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｔｈｅ邋ｖａｒｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｄｕｒｉｎｇ邋ａｄｉｐｏｇｃｎｅｓｉｓ逡逑３９逡逑
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823.81
【參考文獻】
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1 蘇健;蘇恒;;脂肪細胞分化過程中MAPK信號通路的調(diào)控機制[J];生命的化學(xué);2016年02期
2 孔霞;鄭飛;郭凌鄖;楊建業(yè);張蕾;唐俊明;黃永章;王家寧;;VEGF通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑促進骨髓源間充質(zhì)干細胞的增殖[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2010年05期
3 楊彥杰;昝林森;王洪寶;;秦川牛脂聯(lián)素基因SNPs檢測及其與胴體、肉質(zhì)性狀的相關(guān)性[J];遺傳;2009年10期
4 蔣茂瑩;張艷;劉友學(xué);;大鼠前脂肪細胞消化酶原代培養(yǎng)方法改良的探討[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2009年06期
5 張國華;楊公社;屈長青;孫世鐸;;豬前體脂肪細胞的分離培養(yǎng)[J];細胞生物學(xué)雜志;2005年06期
6 屈長青,張國華,陳粉粉,趙麗麗,楊公社;豬前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2005年05期
7 王竹晨,劉建中,李燕,楊冬梓,鄺健全;人前脂肪細胞的原代培養(yǎng)[J];中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年06期
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1 安楊;Lats2通過Hippo信號通路調(diào)控脂肪細胞增殖和分化的分子機制研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年
本文編號：2624996
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/dongwuyixue/2624996.html
【圖文】：
２．３．１延黃牛前體脂肪細胞形態(tài)學(xué)觀察逡逑本研究采用膠原酶消化法分離細胞，在細胞接種后，多種細胞均勻懸浮在培逡逑養(yǎng)液中（圖２．１－Ａ）；用ＰＢＳ沖洗掉未貼壁的雜細胞，前體脂肪細胞輕微貼壁，之逡逑后貼壁的細胞開始逐漸生長（圖２．１－Ｂ和圖２．１－Ｃ）；隨著細胞生長時間的延長，５逡逑ｄ時細胞呈旋渦狀，，細胞生長有一定的紋路（圖２．１－Ｄ），之后由于空間及營養(yǎng)物逡逑質(zhì)的限制，呈現(xiàn)生長抑制不再進行增殖，進而退出增殖周期，在轉(zhuǎn)錄因子的刺激逡逑下啟動隨后的脂肪細胞分化程序。逡逑ＨＨＨＨ逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑？．大《＇邐七、邐，逡逑圖２．１延黃牛前體脂肪細胞的形態(tài)（１０0ｘ）逡逑Ａ：細胞接種２ｈ后形態(tài)；Ｂ：接種２ｄ后細胞形態(tài)；Ｃ：細胞接種３ｄ后形態(tài)；Ｄ：細胞接種５ｄ后形態(tài)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｙａｎ邋Ｙｅｌｌｏｗ邋ｃａｔｔｌｅ邋ｐｒｅ－ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ邋（１０0ｘ）逡逑Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｃｅｌ
邋１０００，邋＾ＯＯｐｍｏｌ邋Ｌ／１濃度及其對應(yīng)的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各孔的吸光值逡逑為ｙ軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為ｘ軸繪制散點圖，并添加趨勢線，顯示公式及ｉ？２值，標(biāo)逡逑準(zhǔn)曲線公式如下：Ｙ＝９Ｅ－０５ｘ－０．００６，邋Ｒ２＝０．９９５。結(jié)果如圖２．４所示，甘油三酯的逡逑含量在前４ｄ時變化緩慢，第４天開始迅速上升。在整個誘導(dǎo)分化的過程中，早逡逑期是形成脂肪細胞的過程，后期脂滴才逐漸積累。逡逑sE逡逑｜邋ｅｏｏ邐／逡逑６００邋／逡逑Ｓ邋ｍ邐／逡逑ｇ邋２００逡逑0＇邐１邐．邐．邐逡逑０邐４邐９逡逑時問（天）逡逑圖２．４誘導(dǎo)分化過程中甘油三酯含量的變化逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｔｈｅ邋ｖａｒｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｄｕｒｉｎｇ邋ａｄｉｐｏｇｃｎｅｓｉｓ逡逑３９逡逑
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823.81
【參考文獻】
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本文編號：2624996
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