發(fā)布時間：2020-04-12 05:35

【摘要】：鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipesifer,RA)是主要侵害鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種接觸性傳染病。本病在世界各地廣泛分布,具有較高的發(fā)病率和死亡率,是當(dāng)前嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一。隨著對細菌毒力因子的深入研究,細菌分泌系統(tǒng)在細菌致病性相關(guān)研究中發(fā)揮著重要作用。近年來,隨著Ⅸ分泌系統(tǒng)(T9SS),又稱為Por分泌系統(tǒng)在擬桿菌門成員中的發(fā)現(xiàn),在GenBank上已公布的全基因組序列的鴨疫里默氏桿菌基因組中均存在完整的T9SS核心組分,研究該分泌系統(tǒng)在細菌與宿主的相互作用以及細菌的致病過程中的作用就尤為值得關(guān)注。本研究構(gòu)建獲得鴨疫里默氏桿菌Yb2株Ⅸ型分泌系統(tǒng)核心組分gldL的基因缺失株以及gldL-gldN基因雙缺失株,并對缺失株進行了生物學(xué)特性分析。此外采用2-D蛋白質(zhì)組合Westerm Blot等方法對Yb2株培養(yǎng)上清中具有免疫原性的蛋白進行了鑒定。1.鴨疫里默氏桿菌Yb2株gldL和gldL-gldN基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究本研究通過擴增gldL基因左、右同源臂連入自殺質(zhì)粒313,通過結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌野生株Yb2,構(gòu)建獲得gldL基因缺失突變株Yb2△gldL;通過結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌Yb2△gldN基因缺失突變株,構(gòu)建獲得gldL-gldN基因雙缺失突變株Yb2△gldL-gldN。然后將野生株Yb2的gldL基因ORF與構(gòu)建的大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌穿梭表達質(zhì)粒pRES1相連接,通過接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將重組質(zhì)粒pRES1-gldL導(dǎo)入缺失株Yb2△gldL中,獲得回復(fù)株cYb2△gldL。生物學(xué)特性分析的結(jié)果表明,與野生株Yb2相比,缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN和回復(fù)株cYb2△gldL的生長曲線無顯著性差異;另外通過蛋白酶水解試驗表明:缺失株Yb2△gldL和Yb2△gldL-gldN在含有脫脂乳的TSA平板上培養(yǎng)24h后無蛋白酶水解能力,通過雛鴨致病性分析以動物實驗LD50的測定結(jié)果顯示:缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN與野生株Yb2相比對雛鴨的LD50分別升高了 48、110倍左右;通過肝臟、腦、血液細菌載量的測定結(jié)果顯示:缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN和回復(fù)株cYb2△gldL感染雛鴨體內(nèi)肝臟、腦的細菌載量均比野生株Yb2顯著性降低,表明缺失株Yb2△gldL、Yb2△gldL-gldN對組織的侵襲力下降。因此,以上結(jié)果證實gldL和gldL-gldN基因的缺失使Ⅸ型分泌系統(tǒng)的功能受損,從而使鴨疫里默氏桿菌對雛鴨的致病性降低。2.鴨疫里默氏桿菌Yb2株培養(yǎng)上清中免疫原性蛋白的鑒定采用TCA沉淀法在Yb2株上清液中加入10%的TCA,在酸性條件下從培養(yǎng)上清中鑒定到了 12種鴨疫里默氏桿菌Yb2株培養(yǎng)上清中具有免疫原性的蛋白。原核表達了 3種具有免疫原性的蛋白P1、P2和P3,經(jīng)免疫雛鴨后攻毒試驗,結(jié)果表明:P1蛋白對雛鴨抵御鴨疫里默氏桿菌感染具有一定的免疫保護性。為本研究鴨疫里默氏菌病新型疫苗的研制打下了基礎(chǔ)。
【圖文】：

系統(tǒng)主要包括以下１３個編碼成分基因：Ｓｏｖ、ＰｏｒＫ、ＰｏｒＬ、ＰｏｒＭ、ＰｏｒＮ、ＰｏｒＰ、ＰｏｒＱ、ＰｏｒＴ、逡逑ＰｏｒＵ、ＰｏｒＶ、ＰｏｒＷ、ＰｏｒＸ、ＰｏｒＹ，其中一些蛋白是通過雙組分系統(tǒng)ｐｏｒＸＹ表達的［４４］。結(jié)逡逑構(gòu)模式圖（如圖１所示），其中細菌的內(nèi)膜部分有ＰｏｒＬ、ＰｏｒＭ、ＰｏｒＫ，而外膜部分有ＰｏｒＮ、逡逑ＰｏｒＰ、ＰｏｒＺ，ＰｏｒＵ編碼的是一種Ｃ端肽酶，牙齦卟啉單胞菌Ｔ９ＳＳ分泌的蛋白絕大多數(shù)含逡逑有氨基酸殘基，，數(shù)量一般保持在７０－８０個Ｃ端結(jié)構(gòu)域ＣＴＤ，當(dāng)?shù)鞍淄ㄟ^Ｔ９ＳＳ時是蛋白分逡逑泌所必需的結(jié)構(gòu)域；ＰｏｒＵ進行切割，Ｃ端暴露于細胞外環(huán)境參與蛋白功能；ＰｏｒＸ、ＰｏｒＹ逡逑分別是反應(yīng)調(diào)節(jié)器和傳感器激酶，當(dāng)其缺失后Ｓｏｖ、ＰｏｒＫ、ＰｏｒＬ、ＰｏｒＭ、ＰｏｒＮ、ＰｏｒＰ、ＰｏｒＴ逡逑表達量顯著下調(diào)［４５４７］。ＰｏｒＺ是近兩年才鑒定到的Ｔ９ＳＳ核心組分，它是ＰｏｒＵ定位于細菌逡逑表面及Ｔ９ＳＳ運載蛋白的翻譯后修飾所必需的［４８］。逡逑

＝卜■：邋ｊ逡逑Ｉ：：＇，逡逑圖１－２質(zhì)粒３１３－ｇＷＺ－ＬＲ的酶切鑒定逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋３＼３－ｇＩｃ／Ｌ－ＬＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ分子標(biāo)準(zhǔn)量ＤＬ１００００邐１．重組質(zhì)粒３１３－ｇＷＺ－ＬＲ的酶切結(jié)果逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ１００００邐１．邋Ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋３１３－ｇＷＩ－ＬＲ邋ｄｉｇｅｓｔｅｄ邋ｂｙ邋ＢａｍＨＩ／ｓｐｈＩ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61

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本文編號：2624345