發(fā)布時(shí)間：2020-04-11 00:22

【摘要】：規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)與CRISPR相關(guān)蛋白(Cas),提供原核生物獲得性、可遺傳的免疫保護(hù),以抵抗外源DNA的入侵。這種免疫防御已在不同亞型CRISPR-Cas系統(tǒng)中被證實(shí),與CRISPR陣列中免疫記憶的形成密切相關(guān),稱為CRISPR適應(yīng)階段或spacer的獲取。Ⅱ-C亞型CRISPR-Cas系統(tǒng)是Ⅱ型系統(tǒng)中最常見的亞型,然而這個(gè)亞型系統(tǒng)很少被研究。前期研究發(fā)現(xiàn),鴨疫里默氏菌CH-2株(RA-CH-2)編碼Ⅱ-C型CRISPR-Cas系統(tǒng)。本論文對(duì)該亞型系統(tǒng)的特征、spacer的獲取(適應(yīng)階段)及抵御外源DNA(干擾階段)進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下:1鴨疫里默氏菌CRISPR-Cas系統(tǒng)生物信息學(xué)分析對(duì)RA-CH-2株基因組(NC_020125.1)的CRISPR-Cas分析,可以確定CRISPR陣列與cas9、cas1和cas2基因序列,及預(yù)測的leader序列與tracRNA序列,其結(jié)構(gòu)為5’-tracRNA-cas9-cas1-cas2-leader-repeat1-spacer1···spacer15-repeat16-3’,表明RA-CH-2株CRISPR-Cas系統(tǒng)屬于Ⅱ-C亞型系統(tǒng)。2鴨疫里默氏菌CRISPR-Cas系統(tǒng)適應(yīng)階段必需基因研究分別構(gòu)建RA-CH-2株cas1、cas2和cas1-cas2基因缺失株,并轉(zhuǎn)入穿梭質(zhì)粒。檢測結(jié)果表明RA缺失cas1或cas2后喪失對(duì)spacer的獲取能力,當(dāng)單基因缺失株攜帶的穿梭質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)Cas1與Cas2使其喪失的spacer獲取能力能夠得到恢復(fù);對(duì)Cas1的E149、H206和E221位氨基酸定點(diǎn)突變?yōu)楸彼岷笃鋝pacer的獲取能力喪失。因此cas1和cas2是RA CRISPR-Cas系統(tǒng)的必需基因,E149、H206和E221位氨基酸是RA Cas1的功能位點(diǎn)。3鴨疫里默氏菌Cas1與Cas2蛋白體外相互作用研究分別構(gòu)建RA-CH-2株Cas1、Cas2和Cas1-Cas2原核表達(dá)重組質(zhì)粒及其相應(yīng)表達(dá)菌,制備兔抗Cas1重組蛋白的多克隆抗體。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)BL21pET30a::cas1-cas2與Cas1定點(diǎn)突變表達(dá)菌并超聲破碎,獲得的上清分別進(jìn)行Ni-NTA pull-down試驗(yàn)與免疫共沉淀試驗(yàn),以分析Cas1與Cas2體外相互作用。結(jié)果表明RA Cas1與Cas2能直接相互作用,并形成穩(wěn)定的復(fù)合物;當(dāng)Cas1的E149、H206和E221位氨基酸突變成丙氨酸后并不影響與Cas2的相互作用。4鴨疫里默氏菌Cas1降解dsDNA的核酶活性研究將純化的Cas1重組蛋白與dsDNA進(jìn)行孵育,在Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(3+)、Zn~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)、Cu~(2+)和Ba~(2+)分別存在的情況下,在不同KCl濃度的反應(yīng)體系中,檢測Cas1蛋白的DNA酶(DNase)活性;對(duì)Cas1的E149、H206和E221位氨基酸突變成丙氨酸后分析其DNase活性。結(jié)果表明,Cas1重組蛋白能夠降解環(huán)狀/線性dsDNA,Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)和Ni~(2+)輔助Cas1蛋白切割dsDNA,Cas1核酶對(duì)金屬離子的偏好依賴于鹽離子濃度。當(dāng)反應(yīng)體系中Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)和Ni~(2+)被EDTA螯合后,Cas1蛋白的DNase活性受到抑制;E149、H206和E221位氨基酸突變后Cas1蛋白的DNase活性受到抑制。因此,RA Cas1蛋白是一個(gè)依賴于金屬離子(Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)和Ni~(2+))的核酶,E149、H206和E221位氨基酸是Cas1的核酶活性位點(diǎn)。5鴨疫里默氏菌Cas9參與CRISPR-Cas系統(tǒng)適應(yīng)階段研究通過基因缺失、氨基酸定點(diǎn)突變等對(duì)RA Cas9參與CRISPR-Cas適應(yīng)階段的作用進(jìn)行評(píng)估。(1)構(gòu)建RA-CH-2株cas9基因缺失株,并分別轉(zhuǎn)入含cas9/cas1-cas2/cas1-cas2-cas9基因的穿梭質(zhì)�；蚩召|(zhì)粒,檢測結(jié)果表明cas9的缺失使RA獲取spacer的能力喪失,因此cas9是RA CRISPR-Cas系統(tǒng)適應(yīng)階段的必需基因;當(dāng)Δcas9攜帶的穿梭質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)Cas1、Cas2與Cas9時(shí),缺失cas9基因的RA即可恢復(fù)對(duì)spacer的獲取能力。(2)對(duì)預(yù)測的Cas9核酶活性位點(diǎn)D8與(或)H792進(jìn)行丙氨酸替代后,其獲取spacer的能力反而增強(qiáng),表明預(yù)測的Cas9核酶活性對(duì)RA CRISPR-Cas系統(tǒng)適應(yīng)階段是不必要的。6鴨疫里默氏菌CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾階段研究質(zhì)粒丟失試驗(yàn)及噬菌體感染試驗(yàn)用以評(píng)估RA CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)外源DNA的抵御。(1)cas1、cas2或cas1-cas2基因缺失后RA質(zhì)粒丟失率均顯著下降,表明RA CRISPR-Cas系統(tǒng)活躍的適應(yīng)階段有助于對(duì)質(zhì)粒DNA的干擾。(2)cas9基因缺失后RA質(zhì)粒丟失率顯著下降,表明RA Cas9參與CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)質(zhì)粒DNA的干擾。(3)攜帶pLMF03::cas1-cas2-cas9質(zhì)粒的Δcas9,若質(zhì)粒上cas9同時(shí)引入D8A和H792A突變時(shí),質(zhì)粒丟失率顯著下降,表明D8和H792位氨基酸是RA Cas9干擾質(zhì)粒DNA的功能位點(diǎn)。(4)攜帶pLMF03::cas1-cas2-cas9質(zhì)粒的Δcas9,與噬菌體混合培養(yǎng)8 h后從衰亡期轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)數(shù)生長期,菌株恢復(fù)生長;當(dāng)質(zhì)粒上的cas9基因同時(shí)引入D8A和H792A突變時(shí),與噬菌體混合培養(yǎng)4 h后進(jìn)入衰亡期。表明RA Cas9是CRISPR-Cas系統(tǒng)抵抗噬菌體的關(guān)鍵元件,D8和H792位氨基酸是RA Cas9的功能位點(diǎn)。(5)分離到一株噬菌體不敏感的RA-CH-2突變株,該菌株的CRISPR1陣列中整合有匹配噬菌體DNA的新spacer,并逃脫噬菌體的感染,表明RA CRISPR-Cas系統(tǒng)提供對(duì)噬菌體的抵抗力。綜上,cas1、cas2和cas9是鴨疫里默氏菌Ⅱ-C型CRISPR-Cas系統(tǒng)獲取spacer的必需基因。Cas1蛋白能降解雙鏈DNA,其核酶活性是系統(tǒng)獲取spacer所必需的。Cas9的D8和H792位氨基酸是系統(tǒng)抵抗質(zhì)粒與噬菌體DNA入侵必不可少的,但對(duì)獲取spacer卻不是必需的。CRISPR-Cas系統(tǒng)通過整合與噬菌體DNA匹配的新spacer,使得RA能夠逃脫噬菌體的感染和裂解。研究結(jié)果初次闡釋了鴨疫里默氏菌CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能以及抵御外源DNA入侵的免疫機(jī)制。
【圖文】：

當(dāng)新 spacer 整合入 RA-CH-2 株 CRISPR1 位點(diǎn)時(shí)，將插入到緊鄰 repeat1 序列的上游，故在圖2-1 中紅色箭頭標(biāo)記處設(shè)計(jì)引物，通過 PCR 檢測及電泳，從擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小可以初步判定是否有 spacer 整合入 CRISPR1 位點(diǎn)。以上，對(duì) RA-CH-2 株CRISPR1-Cas 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的分析，為后續(xù)試驗(yàn)的開展建立了一定的基礎(chǔ)。2.4 鴨疫里默氏菌 Cas 蛋白功能位點(diǎn)的預(yù)測UniProt 程序?qū)?RA-CH-2 株 Cas1、Cas2 和 Cas9 蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果如下：Cas1 蛋白由 299 個(gè)氨基酸組成，預(yù)測分子量大小為 34.78 kDa；Cas2 蛋白由 112個(gè)氨基酸組成，預(yù)測分子量大小為 13.38 kDa；Cas9 蛋白 1400 個(gè)氨基酸組成

滅菌 15 min。配備 2 mg/mLVB1 溶液，0.22 μm 濾膜進(jìn)行過濾除菌。使用養(yǎng)基中依次按 1‰、1%、1%和 1‰加入上述無菌溶液。小牛血清（NBS）：購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司；需要時(shí)小牛血清于滅菌后的培養(yǎng)基中。Amp：購自上海生工生物工程股份有限公司，，1 g 氨芐青霉素粉末溶于 1雙蒸水中，制備儲(chǔ)存濃度為 100 mg/mL 的儲(chǔ)存液，-20 °C 保存；使用濃 μg/mL。Cfx：購自上海生工生物工程股份有限公司，0.05 g 頭孢西丁粉末溶于 5雙蒸水中，制備儲(chǔ)存濃度為 1 mg/mL 的儲(chǔ)存液，-20 °C 保存；使用濃度L。Spc：購自上海生工生物工程股份有限公司，0.5 g 壯觀霉素粉末溶于 1雙蒸水中，制備儲(chǔ)存濃度為 1 mg/mL 的儲(chǔ)存液，-20 °C 保存；使用濃g/mL。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61

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