【摘要】：綿羊瘤胃上皮作為與環(huán)境接觸的免疫界面,能夠分泌具有針對(duì)各種病原體的抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs)。防御素作為機(jī)體內(nèi)正常產(chǎn)生的AMPs,具有廣譜的抗微生物活性,而綿羊β-防御素-1(Sheep β-defensin-1,SBD-1)作為防御素家族的一員,在整個(gè)胃腸道內(nèi)廣泛表達(dá),因此SBD-1可能在綿羊胃腸道先天性免疫中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期的研究表明釀酒酵母菌及其全細(xì)胞壁均能誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞(Ovine ruminal epithelial cells,ORECs)內(nèi)SBD-1的表達(dá),而甘露聚糖作為釀酒酵母細(xì)胞壁的主要成分,具有刺激先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)功能。因此,本試驗(yàn)首先對(duì)ORECs的培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇方法進(jìn)行研究,然后研究了釀酒酵母甘露聚糖對(duì)ORECs SBD-1的表達(dá)影響,最后對(duì)甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)所激活的信號(hào)通路進(jìn)行探索。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)采用胰蛋白酶連續(xù)消化法對(duì)瘤胃組織分別進(jìn)行7次不同時(shí)間(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并對(duì)每次消化后的瘤胃組織和細(xì)胞進(jìn)行觀察,以確定消化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第4次消化后即可開始收集細(xì)胞,并進(jìn)行原代培養(yǎng)。同時(shí)運(yùn)用差時(shí)消化法和差速貼壁法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行純化,并利用免疫組化、免疫熒光、細(xì)胞生長曲線和RT-PCR方法證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為ORECs。然后通過檢測(cè)復(fù)蘇后的細(xì)胞活力和24 h貼壁率發(fā)現(xiàn)凍存液的配制比例為VFBS:VDMEM:VDMSO=9:0:1時(shí),冷凍保護(hù)效果較好。最后對(duì)復(fù)蘇后的ORECs生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明復(fù)蘇后的細(xì)胞同樣具有原代ORECs的生物學(xué)特性,可用于后續(xù)試驗(yàn)研究。(2)用不同濃度(0、10、50、100、200和400 μg/mL)的甘露聚糖刺激ORECs 8 h后,篩選出甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的最佳濃度;然后用最適濃度的甘露聚糖刺激ORECs不同時(shí)間(0、2、4、8、12和24 h)后,篩選出甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的最佳時(shí)間。qPCR和ELISA結(jié)果均顯示甘露聚糖能夠誘導(dǎo)ORECs SBD-1的表達(dá),且當(dāng)濃度為50 μg/mL的甘露聚糖刺激ORECs4h時(shí)SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最大。(3)采用Western blot、RT-PCR、免疫組化、免疫熒光、qPCR和ELISA方法對(duì)甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)所激活的信號(hào)通路進(jìn)行研究。結(jié)果表明:膜受體樹突狀細(xì)胞相關(guān) C 型凝集素 2(Dendritic-cell-associated C-type lectin 2,Dectin-2)和信號(hào)銜接蛋白脾臟酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)在ORECs內(nèi)均表達(dá),并且用Dectin-2和TLR-2的siRNA或特異性封閉抗體處理ORECs后均可以減弱甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1的表達(dá),且阻斷Dectin-2對(duì)SBD-1表達(dá)的抑制作用更明顯。然后用Syk siRNA或Syk特異性抑制劑R406處理細(xì)胞后同樣發(fā)現(xiàn)阻斷Syk能夠降低甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1的表達(dá)。最后分別用p38、JNK、ERK1/2和NF-κB信號(hào)通路的特異性抑制劑處理ORECs后均顯著降低甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1的表達(dá),且p38通路抑制劑效果最明顯。本研究通過消化時(shí)間的確定,成功培養(yǎng)出了 ORECs。凍存液的配制比例為VFBS:VDMEM:VDMSO=9:0:1時(shí),對(duì)ORECs的冷凍保護(hù)效果較好,且復(fù)蘇后的細(xì)胞同樣具有原代ORECs的生物學(xué)特性。此外,甘露聚糖能夠誘導(dǎo)ORECs SBD-1的表達(dá),且膜受體Dectin-2和TLR-2,信號(hào)銜接蛋白Syk以及下游的信號(hào)通路p38、JNK、ERK1/2和NF-κB均參與甘露聚糖誘導(dǎo)SBD-1的表達(dá)過程,但可能以Dectin-2-Syk-p38信號(hào)通路為主要的信號(hào)通路。
【圖文】：

防御素基因編碼結(jié)構(gòu)示意圖(90模型中黃色部分為二硫鍵)hzlFig.l-ISchematicdiagramofthecodingstructureofdefensingene(disulfidebondscolored州lowin3Dmodel)

圖１－２防御素的生物學(xué)活性逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｄｃｆｃｎｓｉｎｓ逡逑
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 詹康;貢笑笑;左曉昕;陳銀銀;占今舜;趙國琦;;奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的培養(yǎng)與鑒定[J];動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào);2015年08期

2 謝芳;潘寒Y，

本文編號(hào)：2618384