【摘要】：PTD-FNK蛋白是一種人造蛋白,是將FNK蛋白與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)融合而形成的人工抗細(xì)胞死亡蛋白,它進(jìn)入細(xì)胞的速度極快,已經(jīng)被證實(shí)對(duì)由各種原因引起的細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用。目前為止,雖然PTD-FNK蛋白的功能研究非常的廣泛,但是未見將其運(yùn)用于保護(hù)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞(TM3)異常凋亡的研究。本試驗(yàn)以TM3為研究對(duì)象,檢測(cè)不同濃度的PTD-FNK蛋白對(duì)二甲磺基乙烷(EDS)誘導(dǎo)的TM3不正常凋亡的保護(hù)效果,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)PTD-FNK蛋白的生理功能提供試驗(yàn)依據(jù),加快其在雄性動(dòng)物生殖調(diào)控方面的臨床應(yīng)用進(jìn)程。具體研究?jī)?nèi)容如下:首先,將TM3體外培養(yǎng)并用3β-HSD細(xì)胞免疫熒光染色對(duì)TM3進(jìn)行純度鑒定;其次,挑取生長(zhǎng)狀態(tài)比較好的TM3,用胰蛋白酶消化并傳代后,當(dāng)TM3長(zhǎng)到大概有80%左右的融合度時(shí),以不同的PTD-FNK蛋白(100、50、5、0.5、0.05 nmol/L)提前孵育TM3 0.5 h,然后用凋亡誘導(dǎo)劑EDS(750μg/mL)對(duì)TM3誘導(dǎo)24 h,用增強(qiáng)型CCK-8法檢測(cè)各組TM3的活力,用Hoechst33342和PI雙染法在熒光顯微鏡下檢測(cè)PTD-FNK蛋白對(duì)TM3凋亡、壞死的影響;最后,用酶標(biāo)儀檢測(cè)PTD-FNK蛋白對(duì)TM3內(nèi)Caspase-3、Caspase-9活性的影響。結(jié)果顯示:(1)體外培養(yǎng)的細(xì)胞在37℃下的細(xì)胞培養(yǎng)箱(含有5%的C02)里,長(zhǎng)勢(shì)樂觀,形態(tài)較好,在12～36 h時(shí)是其對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。經(jīng)3β-HSD染色鑒定后,在熒光顯微鏡下顯示有大量的綠色細(xì)胞顆粒,說明此細(xì)胞是TM3且純度比較高。(2)與EDS陰性對(duì)照組相比,PTD-FNK蛋白試驗(yàn)組的TM3活力均升高。其中0.5 nmol/LPTD-FNK蛋白極顯著增加TM3的活力(P0.01),5、0.05nmol/L的PTD-FNK蛋白顯著增強(qiáng) TM3 的活力(P0.05),50nmol/L、100nmol/L 的 PTD-FNK 蛋白組TM3活力與對(duì)照組相比差異不顯著(P0.05)。(3)TM3經(jīng)Hoechst33342、PI雙染檢測(cè),顯示各組細(xì)胞壞死不明顯,而EDS陰性對(duì)照組有大量的強(qiáng)藍(lán)色熒光以及紅色的熒光,TM3凋亡與壞死最多;與EDS的陰性對(duì)照組相比,0.5nmol/L的PTD-FNK蛋白組顯著降低TM3的凋亡(P0.01),50、5、0.05 nmol/L 的 PTD-FNK 蛋白可顯著降低 TM3 的凋亡(P0.05);100nmol/L的PTD-FNK蛋白組與對(duì)照組相比則差異不顯著(P0.05)。未添加PTD-FNK蛋白和EDS的空白對(duì)照組TM3凋亡得最少。(4)與陰性對(duì)照組相比,0.05、5nmol/L的PTD-FNK蛋白能顯著降低EDS(750μg/mL)作用下 TM3Caspase-3 的活性(P0.05),0.5nmol/L 的 PTD-FNK 蛋白能極顯著降低EDS(750μg/mL)誘導(dǎo)的TM3Caspase-3的活性(P0.01)。與對(duì)照組相比,各個(gè)試驗(yàn)組Caspase-9的活性沒有顯著變化,表明PTD-FNK蛋白抑制TM3凋亡的機(jī)制可能與Caspase-9活性抑制無關(guān)。綜上所述,PTD-FNK蛋白可能通過降低EDS誘導(dǎo)凋亡的體外培養(yǎng)TM3 Caspase-3的活性,降低TM3的凋亡量,最終提高TM3的活力。
【圖文】：

圖２－１邋ＴＭ３邋３Ｐ－ＨＳＤ染色鑒定逡逑

０邋Ｎ邋Ｃ邋０．０５邋０．５邐５邐５０邐１００逡逑ＰＴＤ－ＦＮＫ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋（邋ｎｍｏｌ／Ｌ）逡逑圖２－２邋ＰＴＤ－ＦＮＫ蛋白對(duì)ＥＤＳ誘導(dǎo)凋亡的ＴＭ３活力的影響逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＰＴＤ－ＦＮＫ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋Ｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆ邋ＴＭ３邋Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋－邋Ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＥＤＳ．逡逑（Ａ）增強(qiáng)型ＣＣＫ－８檢測(cè)ＴＭ３的最佳孵育時(shí)間．（Ｂ）增強(qiáng)型ＣＣＫ－８檢測(cè)ＴＭ３的最佳密度曲線．（Ｃ）逡逑增強(qiáng)型ＣＣＫ－８檢測(cè)ＰＴＤ－ＦＮＫ蛋白對(duì)ＥＤＳ誘導(dǎo)凋亡的ＴＭ３活力的影響．（注：＊號(hào)表示差異顯著，逡逑Ｐ＜０．０５；邋＊＊表示差異極顯著，Ｐ＜０．０１）．逡逑（Ａ）邋Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ＣＣＫ－８邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＴＭ３邋ｆｏｒ邋ｏｐｔｉｍａｌ邋ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ邋ｔｉｍｅ．邋（Ｂ）邋Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ＣＣＫ－８邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｔｈｅ邋ｏｐｔｉｍａｌ邋ｃｅｌｌ邋ｄｅｎｓｉｔｙ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ＴＭ３．邋（Ｃ）邋ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＰＴＤ－ＦＮＫ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｎ邋ＥＤＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ逡逑ＴＭ３邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ＣＣＫ－８邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋（Ｎｏｔｅ：＊，邋Ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋＾＜０．０１）．逡逑２．４邋ＴＭ３的凋亡與壞死逡逑經(jīng)Ｉｍａｇｅ邋Ｊ統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如下：ＥＤＳ陰性對(duì)照組（圖Ｂｌ、Ｂ２），有大量的強(qiáng)逡逑藍(lán)色熒光以及較明顯的紅色熒光，其熒光值最大，，表明此組ＴＭ３凋亡與壞死最多；與逡逑添加了邋ＥＤＳ的陰性對(duì)照組相比（圖ＦＩ、Ｆ２）
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S814

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本文編號(hào)：2603538