【摘要】：由于旋毛蟲的傳播途徑復(fù)雜,宿主地理分布廣泛,旋毛蟲病仍未得到有效控制。加強(qiáng)對(duì)該病的診斷和通過有效的疫苗阻斷旋毛蟲的傳播是預(yù)防人類或者家養(yǎng)動(dòng)物感染旋毛蟲病的有效手段。寄生性線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine protease inhibitor,CPI或cystatin)不僅具有獨(dú)特的半胱氨酸蛋白酶抑制活性,而且還可以調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng),在寄生蟲逃避宿主免疫應(yīng)答,適應(yīng)寄生生活中起著重要作用。本研究成功克隆了旋毛蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2基因,并且在原核表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá),純化后的重組蛋白具有蛋白酶抑制活性,可以在不同pH和溫度下抑制人組織蛋白酶B的活性。TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2在旋毛蟲的肌幼蟲、成蟲和新生幼蟲時(shí)期均有轉(zhuǎn)錄,主要表達(dá)于肌幼蟲的表皮和桿狀體中。體外研究了重組TsCystatins對(duì)IFN-γ激活的巨噬細(xì)胞RAW264.7的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組TsCystatins和IFN-γ共同作用于RAW264.7細(xì)胞明顯抑制了NO的產(chǎn)生,并且呈現(xiàn)劑量依賴性。重組TsCystatins能夠抑制IFN-γ激活的RAW264.7細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子(IL-6、IL-12和TNF-α)的分泌,而重組TsCystatins單獨(dú)作用促進(jìn)了抗炎性細(xì)胞因子(IL-10)的分泌。說明TsCystatins是旋毛蟲感染宿主的免疫調(diào)節(jié)分子,通過抑制宿主巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)逃避宿主的免疫應(yīng)答,來達(dá)到在宿主體內(nèi)長期寄生的目的。攻擊感染試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組的TsStefin、TsCystatin1和TsCystatin2能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體,但是不能有效的減少免疫鼠肌肉中旋毛蟲的荷蟲量。為了進(jìn)一步確定TsCystatins對(duì)旋毛蟲感染的免疫保護(hù)力,我們以弓形蟲弱毒株RHΔGRA17為表達(dá)載體,使得TsCystatin2成功表達(dá),且對(duì)該弱毒株的體外裂殖、宿主細(xì)胞的入侵及在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖不產(chǎn)生影響。小鼠免疫RHΔGRA17::TsCystatin2產(chǎn)生較高水平的抗弓形蟲特異性IgG;利用弓形蟲裂解抗原刺激免疫之后的脾細(xì)胞能夠產(chǎn)生較高水平的IL-12及IFN-γ。腹腔感染弓形蟲強(qiáng)毒株試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鼠免疫RHΔGRA17::TsCystatin2能抵抗弓形蟲的再次感染。另外,免疫轉(zhuǎn)基因RHΔGRA17::TsCystatin2蟲株能夠刺激小鼠產(chǎn)生抗旋毛蟲特異性的體液免疫應(yīng)答以及Th1為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答(較高水平的IgG2a、IL-12和IFN-γ)。但是,Th2型細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)在免疫小鼠中并沒有顯著增加,而這種Th1主導(dǎo)的免疫反應(yīng)并不能使免疫小鼠在隨后的旋毛蟲攻擊感染中獲得有效的免疫,即不能有效的減少免疫鼠肌肉中旋毛蟲的荷蟲量。以上研究結(jié)果說明TsCystatins可能不是理想的疫苗候選蛋白。此外,本研究以旋毛蟲屬(Trichinella spp.)線粒體小亞單位核糖體RNA(rrnS)基因?yàn)榘悬c(diǎn),建立了重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)和側(cè)流層析試紙條(LF-RPA)聯(lián)合檢測旋毛蟲感染的診斷方法。該方法可在25-45℃范圍內(nèi)進(jìn)行,10-25 min內(nèi)即可完成,且可檢測到低至100 fg的旋毛蟲DNA,具有簡便、快速、準(zhǔn)確、高特異性和敏感性的特點(diǎn)。
【圖文】：

隨后 Tang（Tang et al., 2015）也證明了此蛋白具有較好的抗原性，可以作為旋毛蟲診斷或疫苗的候選抗原。另外，旋毛蟲 cystatin 樣蛋白可以引起宿主 Th1 和 Th2 混合免疫應(yīng)答，降低 STAT6 的轉(zhuǎn)錄，，抵御宿主的快速排蟲（Liu et al., 2014）。本實(shí)驗(yàn)室采用電子克隆的方法從 GenBank EST 數(shù)據(jù)庫獲得旋毛蟲 cystatin 基因家族的部分 cDNA 序列，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 RT-PCR，克隆得到旋毛蟲 cystatin 基因家族 3 個(gè)成員的完整開放閱讀框，分別命名為 TsCystatin1、TsCystatin2 和TsStefin（付寶權(quán)，2012）。對(duì)其序列的初步分析表明（圖 1.1），獲得的 TsStefin 全長 294 bp，編碼 97 個(gè)氨基酸，不含信號(hào)肽序列。獲得的 TsCystatin1 全長 666 bp，含有 75 bp 的信號(hào)肽序列，編碼 221 個(gè)氨基酸。獲得的 TsCystatin2 全長 423bp，含有 48bp 的信號(hào)肽序列，編碼 140 個(gè)氨基酸。對(duì)其結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，TsStefin 屬于 1 型 cysttins，TsCystatin1 和 TsCystatin2 屬于 2 型 cystatins，與其他線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子相似，三個(gè)基因都具有半胱氨酸蛋白酶抑制因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，保守的 Gly 殘基及 QXVXG 基序。TsCystatin1 和 TsCystatin2 編碼蛋白在 C 末端有兩個(gè)二硫鍵（其它已知線蟲只有一個(gè)二硫鍵），TsStefin 編碼蛋白 C 末端沒有二硫鍵，但是有一個(gè)潛在的 N-糖基化位點(diǎn)（stefin 家族一般都不是糖蛋白）。對(duì)其功能研究的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TsCystatin1、TsCystatin2 和 TsStefin 對(duì)組織蛋白酶 L 均具有一定的抑制作用，說明本實(shí)驗(yàn)室鑒定的三個(gè)旋毛蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子均具有蛋白酶抑制活性。但是旋毛蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子是否具有類似其他寄生性線蟲對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)作用是我們深入研究此蛋白功能的重點(diǎn)。

圖 1.2 RPA 擴(kuò)增反應(yīng)的原理（引自 Li et al., 2018）Fig. 1.2 RPAreaction mechanism命周期的過程中要不可避免地與宿主組織進(jìn)行親密接給宿主的免疫系統(tǒng)。在長期與宿主免疫系統(tǒng)接觸的過程多種機(jī)制以使蠕蟲能夠在宿主體內(nèi)存活。寄生蟲 cysta以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答非相關(guān)的炎癥反應(yīng)。如 Av-cystatin 在兩炎癥反應(yīng)。在氣道高反應(yīng)性小鼠模型中，過敏原致敏過了幾種疾病參數(shù)的顯著降低。Av-cystatin 顯著降低了肺部支氣管粘液的產(chǎn)生。這些作用主要依賴于巨噬細(xì)胞和 除巨噬細(xì)胞后這種影響消失（Schnoeller et al., 2008）。過度的Th2型炎癥反應(yīng)抑制梯牧草花粉引起的過敏反應(yīng)（睪吸蟲的 Ⅰ 型半胱氨酸蛋白酶抑制劑為實(shí)驗(yàn)材料，建立現(xiàn)炎癥和腸損傷明顯減輕，這與 IL-10 升高引起巨噬蟲能夠在人體內(nèi)存活多年，其半胱氨酸蛋白酶抑制因子
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.7

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