【摘要】：多數(shù)補氣類中藥在增強動物免疫力和恢復(fù)受免疫抑制動物的免疫力方面具有獨特功效。本研究選用具有免疫增強作用的黃芪和白術(shù)兩味補氣類藥材,經(jīng)過水提醇沉、制粒、干燥等工序制備成復(fù)方芪術(shù)顆粒(Compound HuangqiBaizhu granules,CHBG),并進行了藥物制劑學、毒理學以及藥效學方面的研究,以期獲得一種新的獸用免疫增強劑�，F(xiàn)將研究結(jié)果分述如下:1.CHBG黃芪白術(shù)配比篩選為了獲取療效更優(yōu)的CHBG,本文以雛雞為試驗動物,以黃芪與白術(shù)1:3～3:1不同比例配伍制備的顆粒為試驗藥物,同時設(shè)立疫苗免疫對照組,通過考察試驗藥物對新城疫(ND)疫苗抗體水平影響而篩選黃芪與白術(shù)的配伍比例。結(jié)果顯示,當黃芪與白術(shù)比例為1:1時,雛雞ND抗體水平較疫苗免疫對照組顯著升高(P0.05),且其抗體水平在所有藥物試驗組中最高。結(jié)果表明,黃芪與白術(shù)比例為1:1時的顆粒劑具有較好的免疫增強作用,因此以此為基礎(chǔ)制備CHBG。2.CHBG的制備及穩(wěn)定性研究為了制備質(zhì)量穩(wěn)定、可控的GHBG,本文采用薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)法確定黃芪、白術(shù)的藥材質(zhì)量;在此基礎(chǔ)上采用Ca(OH)2的堿水提醇沉的方法獲取黃芪白術(shù)提取物,然后加入輔料、采用濕法制粒、干燥的工藝制得CHBG,再通過加速試驗和長期穩(wěn)定性試驗考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示:(1)在黃芪和白術(shù)各自TLC圖譜中,樣品藥材和對照品藥材在相同位置顯示相同熒光斑點;且兩味藥材的HPLC特征圖譜與對照品藥材的相似度均達到0.90以上,說明選用藥材合格;(2)制得黃芪、白術(shù)的混合粗多糖,試驗三批次的多糖平均得率為7.58%,其多糖含量為73.83%。制得的CHBG成品,每1 g相當于原生藥2 g;(3)CHBG以市售鋁塑包裝密封后,在溫度40±2℃,相對濕度為75±5%的環(huán)境中加速試驗6個月以及在溫度25±2℃、相對濕度60±10%的環(huán)境中放置18個月后,其外觀性狀、鑒別、含量等質(zhì)量指標均符合CHBG質(zhì)量標準要求。以上實驗結(jié)果表明:選用合格的藥材,采用Ca(OH)2的堿水提醇沉、噴霧干燥、濕法制粒獲得的CHBG質(zhì)量穩(wěn)定,有效期可達18個月。3.CHBG質(zhì)量標準研究為使CHBG質(zhì)量可控,借鑒藥典方法和采用TLC、HPLC等方法,建立CHBG的質(zhì)量標準。結(jié)果:參考中國獸藥典建立了 CHBG的含量檢測方法以及確定了 CHBG的外觀性狀、水分、粒度、溶化性、微生物限度等檢查項目;采用TLC法建立了 CHBG定性鑒別多糖、黃芪甲苷、白術(shù)的方法;參考中國獸藥典建立了 HLPC檢查CHBG中單糖、雙糖含量的方法,并規(guī)定了檢出限度;同時,采用HLPC法對9批CHBG特征圖譜進行了考察,建立了 CHBG的指紋圖譜。結(jié)果表明,本試驗建立的質(zhì)量標準可用于CHBG的質(zhì)量控制。4.CHBG安全性評價采用改良寇氏法和最大耐受藥量試驗法評價CHBG安全性,為臨床安全用藥提供依據(jù)。改良寇氏法未能測定出CHBG對小鼠口服的LD50,但最大耐受藥量試驗法測得CHBG對小鼠口服的最大耐受劑量為180 g/(kg·bw)。在最大耐受藥量時,小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)無明顯變化。實驗結(jié)果表明:CHBG對實驗小鼠是安全的。5.CHBG對小鼠非特異性免疫調(diào)節(jié)作用研究為探討CHBG對免疫缺陷動物的免疫調(diào)節(jié)作用,本文以小鼠為試驗對象,采用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)制作免疫抑制模型,再分別設(shè)立空白組、Cy組、Cy+CHBG3.75組(注:給藥劑量為3.75g/(kg.bw),本節(jié)下同)、Cy+CHBG7.5組、Cy+CHBG15.0組,并分別考察CHBG對小鼠免疫器官指數(shù)、碳粒廓清功能、脾淋巴細胞增殖、血清溶菌酶及TNF-α、IL-2、IL-4、IFN-γ等細胞因子的影響。同時設(shè)立空白組、黃芪多糖組、CHBG3.75組、CHBG7.5組、CHBG15.0組,采用流式細胞術(shù)測定CHBG對正常小鼠脾淋巴細胞亞群的影響。實驗結(jié)果顯示:(1)Cy處理可引起脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)下降,并能抑制脾淋巴細胞增殖,導(dǎo)致血清溶菌酶含量以及TNF-α、IL-2、IL-4、IFN-y等細胞因子水平下降。其中脾臟指數(shù)、血清溶菌酶含量以及IFN-y等細胞因子水平比空白組顯著下降(P0.05),說明Cy處理引起了明顯的免疫抑制。(2)與Cy組比較,CHBG15.0可顯著提高脾臟指數(shù)、IFN-y的含量(P0.05),極顯著提高血清溶菌酶的含量(P0.01);CHBG7.5可極顯著提高脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、血清溶菌酶的含量(P0.01);CHBG3.75可顯著恢復(fù)并促進小鼠脾淋巴細胞增殖、顯著提高IL-4的含量(P0.05),極顯著提高脾臟指數(shù)、血清溶菌酶的含量(P0.01)。CHBG各劑量組均可提高碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù),但差異不顯著(P0.05);對TNF-α、IL-2的生成也無明顯影響。(3)CHBG3 75可顯著降低正常小鼠CD8+T細胞的數(shù)量(P0.05),并顯著提高CD4+/CD8+比值(P0.05),且除CHBG15.0組的CD4+T細胞的數(shù)量和CD4+/CD8+的比值顯著低于黃芪多糖組(P0.05),CD8+T細胞的數(shù)量顯著高于黃芪多糖組(P0.05)外,CHBG3 75組和CHBG7.5組的CD4+、CD8+T細胞的數(shù)量以及CD4+/CD8+的比值均與黃芪多糖組的差異不顯著(P0.05)。以上試驗結(jié)果表明:CHBG可明顯恢復(fù)Cy所致小鼠免疫器官發(fā)育的抑制作用,能增強Con A誘導(dǎo)的脾淋巴細胞增殖反應(yīng);增強單核巨噬細胞的吞噬功能、促進溶菌酶釋放,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IFN-γ、提高血清中IL-4的含量,還可提高CD4+/CD8+T淋巴細胞比值。6.CHBG對ND疫苗免疫效果的影響為考察CHBG對ND疫苗免疫效果。以口服0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 g/L的劑量在每次免疫后連續(xù)給藥7 d,考察不同劑量CHBG對雛雞ND抗體水平的影響;以整個免疫期連續(xù)給藥、首免和二免后連續(xù)給藥1周以及首免后給藥1周的三種方案給藥,考察CHBG的不同給藥方案對雛雞ND抗體水平的影響。結(jié)果顯示:(1)當口服不同劑量CHBG時,與疫苗免疫對照組比較,在首免后的第1、2周,CHBG10(注:給藥劑量為1.0 g/L飲水給藥,本節(jié)下同)組的抗體水平顯著升高(P0.05),在二免后第1、2周時,抗體水平極顯著升高(P0.01)。與黃芪多糖組比較,CHBG各劑量組中除CHBG5.0組在35日齡時的ND抗體水平顯著低于黃芪多糖組外(P0.05),而其余各組與其差異均不顯著(P0.05)。(2)采取不同給藥方案時,與免疫對照組比較,在幾種方案中,以每次免疫ND疫苗后,飲水給予1.0 g/L劑量的CHBG,并連續(xù)給藥7 d的方案較好,其在首免后第1、2周,雛雞ND抗體水平可顯著增加(P0.05),在二免后第1、2周時,雛雞ND抗體水平極顯著增加(P0.01);且用藥成本低。綜上所述,采用本試驗方法制備的CHBG安全、穩(wěn)定;同時建立了 CHBG質(zhì)量標準,其檢測方法簡單、可行,可用于CHBG的質(zhì)量控制。動物試驗證實CHBG既可以恢復(fù)和增強機體的非特異性免疫,也能增強機體的特異性免疫,同時提供了 CHBG的臨床使用方案,即每次免疫后以1.0 g/L劑量飲水連續(xù)給藥7 d,有助于雛雞ND抗體水平的提高,可為雛雞提供更好的保護。
【圖文】：

Ａ邐Ｂ逡逑圖３－２．白術(shù)藥材的鑒別（Ａ：白術(shù)對照藥材，Ｂ：白術(shù)藥材）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２．邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ邋Ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａｅｅ邋Ｒｈｉｚｏｍａ逡逑３．１．２黃芪及白術(shù)藥材的高效液相色譜指紋圖譜鑒別逡逑由圖３－３可知，黃芪藥材與黃芪對照藥材的高效液相色譜指紋圖譜峰部分的峰高、峰逡逑面積、保留時間相對穩(wěn)定。雖與馬學琴報道的黃芪指紋圖譜有所差異，但通過《中藥色譜逡逑指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)２０１２版》軟件分析，黃芪藥材與黃芪對照藥材的指紋圖譜的相逡逑似度為０．９７２，超過了邋０．９０，說明二者相似度高，本試驗所選黃芪藥材合格。逡逑由圖３－４可知，白術(shù)藥材與白術(shù)對照藥材因其中部分組分含量多少不完全一致，使高逡逑效液相色譜指紋圖譜峰部分峰高、峰面積有差異，但其保留時間相對穩(wěn)定，并且與陳琴華逡逑等文獻報道基本一致。并且通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)２０１２版》軟件分析，逡逑

逑霄逡逑Ａ邐Ｂ邐ＣＤ逡逑圖３－１．黃芪藥材的鑒別（Ａ：黃芪對照藥材，Ｂ：黃芪藥材，，Ｃ：黃芪甲苷對照品，Ｄ：黃芪藥材）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１．邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｓｔｒａｇａｌｉ邋Ｒａｄｉｘ逡逑Ａ邐Ｂ逡逑圖３－２．白術(shù)藥材的鑒別（Ａ：白術(shù)對照藥材，Ｂ：白術(shù)藥材）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２．邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ邋Ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａｅｅ邋Ｒｈｉｚｏｍａ逡逑３．１．２黃芪及白術(shù)藥材的高效液相色譜指紋圖譜鑒別逡逑由圖３－３可知，黃芪藥材與黃芪對照藥材的高效液相色譜指紋圖譜峰部分的峰高、峰逡逑面積、保留時間相對穩(wěn)定。雖與馬學琴報道的黃芪指紋圖譜有所差異，但通過《中藥色譜逡逑指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)２０１２版》軟件分析，黃芪藥材與黃芪對照藥材的指紋圖譜的相逡逑似度為０．９７２，超過了邋０．９０，說明二者相似度高，本試驗所選黃芪藥材合格。逡逑由圖３－４可知，白術(shù)藥材與白術(shù)對照藥材因其中部分組分含量多少不完全一致，使高逡逑效液相色譜指紋圖譜峰部分峰高、峰面積有差異，但其保留時間相對穩(wěn)定，并且與陳琴華逡逑等文獻報道基本一致。并且通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)２０１２版》軟件分析
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S853.76

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本文編號：2599000