【摘要】：多數(shù)補(bǔ)氣類中藥在增強(qiáng)動(dòng)物免疫力和恢復(fù)受免疫抑制動(dòng)物的免疫力方面具有獨(dú)特功效。本研究選用具有免疫增強(qiáng)作用的黃芪和白術(shù)兩味補(bǔ)氣類藥材,經(jīng)過(guò)水提醇沉、制粒、干燥等工序制備成復(fù)方芪術(shù)顆粒(Compound HuangqiBaizhu granules,CHBG),并進(jìn)行了藥物制劑學(xué)、毒理學(xué)以及藥效學(xué)方面的研究,以期獲得一種新的獸用免疫增強(qiáng)劑。現(xiàn)將研究結(jié)果分述如下:1.CHBG黃芪白術(shù)配比篩選為了獲取療效更優(yōu)的CHBG,本文以雛雞為試驗(yàn)動(dòng)物,以黃芪與白術(shù)1:3～3:1不同比例配伍制備的顆粒為試驗(yàn)藥物,同時(shí)設(shè)立疫苗免疫對(duì)照組,通過(guò)考察試驗(yàn)藥物對(duì)新城疫(ND)疫苗抗體水平影響而篩選黃芪與白術(shù)的配伍比例。結(jié)果顯示,當(dāng)黃芪與白術(shù)比例為1:1時(shí),雛雞ND抗體水平較疫苗免疫對(duì)照組顯著升高(P0.05),且其抗體水平在所有藥物試驗(yàn)組中最高。結(jié)果表明,黃芪與白術(shù)比例為1:1時(shí)的顆粒劑具有較好的免疫增強(qiáng)作用,因此以此為基礎(chǔ)制備CHBG。2.CHBG的制備及穩(wěn)定性研究為了制備質(zhì)量穩(wěn)定、可控的GHBG,本文采用薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)法確定黃芪、白術(shù)的藥材質(zhì)量;在此基礎(chǔ)上采用Ca(OH)2的堿水提醇沉的方法獲取黃芪白術(shù)提取物,然后加入輔料、采用濕法制粒、干燥的工藝制得CHBG,再通過(guò)加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示:(1)在黃芪和白術(shù)各自TLC圖譜中,樣品藥材和對(duì)照品藥材在相同位置顯示相同熒光斑點(diǎn);且兩味藥材的HPLC特征圖譜與對(duì)照品藥材的相似度均達(dá)到0.90以上,說(shuō)明選用藥材合格;(2)制得黃芪、白術(shù)的混合粗多糖,試驗(yàn)三批次的多糖平均得率為7.58%,其多糖含量為73.83%。制得的CHBG成品,每1 g相當(dāng)于原生藥2 g;(3)CHBG以市售鋁塑包裝密封后,在溫度40±2℃,相對(duì)濕度為75±5%的環(huán)境中加速試驗(yàn)6個(gè)月以及在溫度25±2℃、相對(duì)濕度60±10%的環(huán)境中放置18個(gè)月后,其外觀性狀、鑒別、含量等質(zhì)量指標(biāo)均符合CHBG質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:選用合格的藥材,采用Ca(OH)2的堿水提醇沉、噴霧干燥、濕法制粒獲得的CHBG質(zhì)量穩(wěn)定,有效期可達(dá)18個(gè)月。3.CHBG質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究為使CHBG質(zhì)量可控,借鑒藥典方法和采用TLC、HPLC等方法,建立CHBG的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果:參考中國(guó)獸藥典建立了 CHBG的含量檢測(cè)方法以及確定了 CHBG的外觀性狀、水分、粒度、溶化性、微生物限度等檢查項(xiàng)目;采用TLC法建立了 CHBG定性鑒別多糖、黃芪甲苷、白術(shù)的方法;參考中國(guó)獸藥典建立了 HLPC檢查CHBG中單糖、雙糖含量的方法,并規(guī)定了檢出限度;同時(shí),采用HLPC法對(duì)9批CHBG特征圖譜進(jìn)行了考察,建立了 CHBG的指紋圖譜。結(jié)果表明,本試驗(yàn)建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于CHBG的質(zhì)量控制。4.CHBG安全性評(píng)價(jià)采用改良寇氏法和最大耐受藥量試驗(yàn)法評(píng)價(jià)CHBG安全性,為臨床安全用藥提供依據(jù)。改良寇氏法未能測(cè)定出CHBG對(duì)小鼠口服的LD50,但最大耐受藥量試驗(yàn)法測(cè)得CHBG對(duì)小鼠口服的最大耐受劑量為180 g/(kg·bw)。在最大耐受藥量時(shí),小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CHBG對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠是安全的。5.CHBG對(duì)小鼠非特異性免疫調(diào)節(jié)作用研究為探討CHBG對(duì)免疫缺陷動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)作用,本文以小鼠為試驗(yàn)對(duì)象,采用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)制作免疫抑制模型,再分別設(shè)立空白組、Cy組、Cy+CHBG3.75組(注:給藥劑量為3.75g/(kg.bw),本節(jié)下同)、Cy+CHBG7.5組、Cy+CHBG15.0組,并分別考察CHBG對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)、碳粒廓清功能、脾淋巴細(xì)胞增殖、血清溶菌酶及TNF-α、IL-2、IL-4、IFN-γ等細(xì)胞因子的影響。同時(shí)設(shè)立空白組、黃芪多糖組、CHBG3.75組、CHBG7.5組、CHBG15.0組,采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CHBG對(duì)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)Cy處理可引起脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)下降,并能抑制脾淋巴細(xì)胞增殖,導(dǎo)致血清溶菌酶含量以及TNF-α、IL-2、IL-4、IFN-y等細(xì)胞因子水平下降。其中脾臟指數(shù)、血清溶菌酶含量以及IFN-y等細(xì)胞因子水平比空白組顯著下降(P0.05),說(shuō)明Cy處理引起了明顯的免疫抑制。(2)與Cy組比較,CHBG15.0可顯著提高脾臟指數(shù)、IFN-y的含量(P0.05),極顯著提高血清溶菌酶的含量(P0.01);CHBG7.5可極顯著提高脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、血清溶菌酶的含量(P0.01);CHBG3.75可顯著恢復(fù)并促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、顯著提高IL-4的含量(P0.05),極顯著提高脾臟指數(shù)、血清溶菌酶的含量(P0.01)。CHBG各劑量組均可提高碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù),但差異不顯著(P0.05);對(duì)TNF-α、IL-2的生成也無(wú)明顯影響。(3)CHBG3 75可顯著降低正常小鼠CD8+T細(xì)胞的數(shù)量(P0.05),并顯著提高CD4+/CD8+比值(P0.05),且除CHBG15.0組的CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和CD4+/CD8+的比值顯著低于黃芪多糖組(P0.05),CD8+T細(xì)胞的數(shù)量顯著高于黃芪多糖組(P0.05)外,CHBG3 75組和CHBG7.5組的CD4+、CD8+T細(xì)胞的數(shù)量以及CD4+/CD8+的比值均與黃芪多糖組的差異不顯著(P0.05)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明:CHBG可明顯恢復(fù)Cy所致小鼠免疫器官發(fā)育的抑制作用,能增強(qiáng)Con A誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng);增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能、促進(jìn)溶菌酶釋放,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ、提高血清中IL-4的含量,還可提高CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值。6.CHBG對(duì)ND疫苗免疫效果的影響為考察CHBG對(duì)ND疫苗免疫效果。以口服0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 g/L的劑量在每次免疫后連續(xù)給藥7 d,考察不同劑量CHBG對(duì)雛雞ND抗體水平的影響;以整個(gè)免疫期連續(xù)給藥、首免和二免后連續(xù)給藥1周以及首免后給藥1周的三種方案給藥,考察CHBG的不同給藥方案對(duì)雛雞ND抗體水平的影響。結(jié)果顯示:(1)當(dāng)口服不同劑量CHBG時(shí),與疫苗免疫對(duì)照組比較,在首免后的第1、2周,CHBG10(注:給藥劑量為1.0 g/L飲水給藥,本節(jié)下同)組的抗體水平顯著升高(P0.05),在二免后第1、2周時(shí),抗體水平極顯著升高(P0.01)。與黃芪多糖組比較,CHBG各劑量組中除CHBG5.0組在35日齡時(shí)的ND抗體水平顯著低于黃芪多糖組外(P0.05),而其余各組與其差異均不顯著(P0.05)。(2)采取不同給藥方案時(shí),與免疫對(duì)照組比較,在幾種方案中,以每次免疫ND疫苗后,飲水給予1.0 g/L劑量的CHBG,并連續(xù)給藥7 d的方案較好,其在首免后第1、2周,雛雞ND抗體水平可顯著增加(P0.05),在二免后第1、2周時(shí),雛雞ND抗體水平極顯著增加(P0.01);且用藥成本低。綜上所述,采用本試驗(yàn)方法制備的CHBG安全、穩(wěn)定;同時(shí)建立了 CHBG質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),其檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、可行,可用于CHBG的質(zhì)量控制。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)CHBG既可以恢復(fù)和增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫,也能增強(qiáng)機(jī)體的特異性免疫,同時(shí)提供了 CHBG的臨床使用方案,即每次免疫后以1.0 g/L劑量飲水連續(xù)給藥7 d,有助于雛雞ND抗體水平的提高,可為雛雞提供更好的保護(hù)。
【圖文】：

Ａ邐Ｂ逡逑圖３－２．白術(shù)藥材的鑒別（Ａ：白術(shù)對(duì)照藥材，Ｂ：白術(shù)藥材）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２．邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ邋Ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａｅｅ邋Ｒｈｉｚｏｍａ逡逑３．１．２黃芪及白術(shù)藥材的高效液相色譜指紋圖譜鑒別逡逑由圖３－３可知，黃芪藥材與黃芪對(duì)照藥材的高效液相色譜指紋圖譜峰部分的峰高、峰逡逑面積、保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定。雖與馬學(xué)琴報(bào)道的黃芪指紋圖譜有所差異，但通過(guò)《中藥色譜逡逑指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)２０１２版》軟件分析，黃芪藥材與黃芪對(duì)照藥材的指紋圖譜的相逡逑似度為０．９７２，超過(guò)了邋０．９０，說(shuō)明二者相似度高，本試驗(yàn)所選黃芪藥材合格。逡逑由圖３－４可知，白術(shù)藥材與白術(shù)對(duì)照藥材因其中部分組分含量多少不完全一致，使高逡逑效液相色譜指紋圖譜峰部分峰高、峰面積有差異，但其保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，并且與陳琴華逡逑等文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。并且通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)２０１２版》軟件分析，逡逑

逑霄逡逑Ａ邐Ｂ邐ＣＤ逡逑圖３－１．黃芪藥材的鑒別（Ａ：黃芪對(duì)照藥材，Ｂ：黃芪藥材，，Ｃ：黃芪甲苷對(duì)照品，Ｄ：黃芪藥材）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１．邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｓｔｒａｇａｌｉ邋Ｒａｄｉｘ逡逑Ａ邐Ｂ逡逑圖３－２．白術(shù)藥材的鑒別（Ａ：白術(shù)對(duì)照藥材，Ｂ：白術(shù)藥材）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２．邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓ邋Ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａｅｅ邋Ｒｈｉｚｏｍａ逡逑３．１．２黃芪及白術(shù)藥材的高效液相色譜指紋圖譜鑒別逡逑由圖３－３可知，黃芪藥材與黃芪對(duì)照藥材的高效液相色譜指紋圖譜峰部分的峰高、峰逡逑面積、保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定。雖與馬學(xué)琴報(bào)道的黃芪指紋圖譜有所差異，但通過(guò)《中藥色譜逡逑指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)２０１２版》軟件分析，黃芪藥材與黃芪對(duì)照藥材的指紋圖譜的相逡逑似度為０．９７２，超過(guò)了邋０．９０，說(shuō)明二者相似度高，本試驗(yàn)所選黃芪藥材合格。逡逑由圖３－４可知，白術(shù)藥材與白術(shù)對(duì)照藥材因其中部分組分含量多少不完全一致，使高逡逑效液相色譜指紋圖譜峰部分峰高、峰面積有差異，但其保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，并且與陳琴華逡逑等文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。并且通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)２０１２版》軟件分析
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S853.76

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本文編號(hào)：2599000