【摘要】：禽偏肺病毒(Avian Metapneumovrus,aMPV)的自然宿主是火雞,其次是雞。aMPV感染火雞導(dǎo)致火雞鼻氣管炎(Turkey rhinotracheitis,TRT),引起火雞嚴(yán)重的呼吸道疾病。aMPV感染雞導(dǎo)致雞的腫頭綜合癥(Swollen head syndrome,SHS),單一感染時(shí)死亡率較低(5%~10%),但引起產(chǎn)蛋量下降(10%~30%),其更大的危害在于aMPV感染后,常繼發(fā)其它細(xì)菌感染,引起嚴(yán)重的呼吸道癥狀,死亡率高達(dá)25%。目前,除大洋洲以外的世界各地均有該病的報(bào)道。我國(guó)首次在1999年分離到aMPV,隨后流行病學(xué)調(diào)查表明,我國(guó)部分養(yǎng)殖場(chǎng)aMPV的感染率相當(dāng)高,該病對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的危害日益加重。由于aMPV分離非常困難,所以國(guó)內(nèi)關(guān)于aMPV的分子生物學(xué)特征及致病性鮮有研究,不利于該病的有效防控。本研究將疑似腫頭綜合癥的雞的鼻甲骨和肺臟研磨后分別種于Vero細(xì)胞,盲傳5代,觀察到有一份接種鼻甲骨樣品的Vero細(xì)胞變圓、聚堆形成合胞體,具有aMPV典型的細(xì)胞病變(CPE)特征,將其命名為L(zhǎng)N16。電鏡觀察負(fù)染的LN16分離株的病毒粒子呈現(xiàn)多形性,直徑約為50-200 nm,偶見(jiàn)直徑為500 nm的病毒粒子,具有典型的副黏病毒的形態(tài)特征;亞型特異性的RTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,LN16分離株僅擴(kuò)增出了B亞型特異性條帶;進(jìn)一步擴(kuò)增和測(cè)定了LN16分離株的G基因序列,分析表明其G基因與B亞型aMPV的同源性均高于93.8%,而與A、C和D亞型aMPV的同源性都低于63.7%;進(jìn)一步利用B亞型aMPV特異性的陽(yáng)性血清進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示感染LN16的Vero細(xì)胞有特異性的綠色熒光信號(hào)。綜合以上結(jié)果,表明LN16分離株為B亞型aMPV。為了解LN16分離株的分子特征,設(shè)計(jì)合成了7對(duì)引物測(cè)定其全基因組序列。測(cè)序結(jié)果顯示,LN16分離株基因組全長(zhǎng)為13,513 bp,編碼9個(gè)蛋白。將其全基因組序列提交至GenBank(登陸號(hào):MH745147),該序列是第一個(gè)雞源的B亞型aMPV的全基因組序列。與火雞源B亞型aMPV分離株序列比較發(fā)現(xiàn),LN16分離株的全基因組序列與火雞源的同源性為97.6%,8個(gè)編碼基因的同源性為95.1%-98.4%,相對(duì)保守,但基因間隔區(qū)出現(xiàn)堿基的插入和刪除,存在明顯差異。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)LN16分離株對(duì)雞的致病性,將LN16分別感染3、6、9和15周齡的SPF雞。觀察發(fā)現(xiàn),感染后3-6 d的SPF雞均出現(xiàn)流鼻涕、甩頭、流眼淚及精神萎靡等臨床癥狀,各組的發(fā)病率均在70%及以上;感染后2-5 d的SPF雞出現(xiàn)排毒,第4 d排毒率最高,達(dá)到83.6%;感染后的2-5 d,在鼻甲骨、氣管、喉頭等上呼吸道組織中檢測(cè)到病毒,偶爾也在免疫器官胸腺中檢測(cè)到病毒;感染組SPF雞的胸腺出血,鼻甲骨和肺臟出現(xiàn)炎癥等病理變化。這些結(jié)果表明,LN16分離株對(duì)SPF雞有明顯的致病性。本研究成功地從發(fā)病雞群中分離到一株B亞型aMPV,擴(kuò)增獲得首個(gè)雞源B亞型aMPV的全基因組序列,該分離株對(duì)不同日齡的SPF雞有明顯的致病性,這些研究結(jié)果豐富了aMPV的流行病學(xué)資料,同時(shí)也為疫苗等防控產(chǎn)品的研制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 B亞型禽偏肺病毒的分離.2 LN16 分離株的電鏡觀察將 LN16 分離株病毒粒子負(fù)染后，，在電鏡下觀察呈現(xiàn)多形性，近似球形，直徑大約 nm，偶見(jiàn)直徑為 500 nm 的病毒粒子（圖 2.2）。該病毒形態(tài)是典型的副黏病毒形態(tài)6 分離株屬于副黏病毒科。

圖 2.2 LN16 毒株的負(fù)染電鏡觀察Fig. 2.2 Electron microscope observation of LN16亞型特異性 RT-PCR 鑒定次的 LN16 分離株培養(yǎng)液，利用亞型特異性引物對(duì)其進(jìn)行 的 PCR 產(chǎn)物條帶大小約為 387 bp，與 aMPV/B 的陽(yáng)性到 aMPV/A 和 aMPV/C，該結(jié)果證實(shí) LN16 毒株屬于 B 亞型
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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