【摘要】：鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要病原,我們?cè)陂_展RA CH-1株基因組功能注釋時(shí),發(fā)現(xiàn)編碼B739-1124和B739-1125蛋白的基因具有多糖輸出蛋白(wza)和多糖共聚酶蛋白(wzc)基因的生物信息學(xué)特性,為探究RA wza和RA wzc基因功能,我們通過基因缺失等方法開展系列研究,主要內(nèi)容和結(jié)果如下:1.鴨疫里默氏菌wza及wzc基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性測(cè)定通過同源重組構(gòu)建RA CH-1株的wza基因缺失(RA CH-1Δwza)株、wzc基因缺失(RA CH-1Δwzc)株、wza和wzc雙基因缺失(RA CH-1Δwzac)株及對(duì)應(yīng)的缺失回補(bǔ)株(cRA CH-1Δwza株、cRA CH-1Δwzc株),對(duì)wza及wzc基因缺失后RA的生物學(xué)特性檢測(cè),結(jié)果表明:(1)RA在TSA固體培養(yǎng)基生長形成的菌落由起隆、表面濕潤、有光澤菌落變?yōu)楸馄�、表面粗糙菌�?且菌落直徑變小,菌落黏液化特性消失;(2)印度墨汁染色結(jié)果顯示,莢膜結(jié)構(gòu)不完整或未能形成莢膜;(3)透射電鏡下,可觀察到莢膜變薄甚至消失;(4)生長繁殖的速度減緩,進(jìn)入各生長周期的時(shí)間均往后推延2 h左右;(5)經(jīng)過蛋白酶K處理、SDS-PAGE電泳及銀染等方法鑒定,wza、wzc參與RA的莢膜多糖(CPS)合成而不是脂多糖(LPS)的合成;(6)Percoll密度梯度離心證實(shí)其浮力密度增強(qiáng);(7)抗干燥、抗氧化(H_2O_2)能力顯著降低。相應(yīng)的回補(bǔ)株能夠使缺失株的以上生物學(xué)特性得以恢復(fù)至野生株(RA CH-1)水平或接近野生株水平。2.wza及wzc基因缺失對(duì)鴨疫里默氏菌表面性質(zhì)的影響細(xì)菌表面疏水性與自動(dòng)聚集能力是影響細(xì)菌菌體黏附力的重要因素,其中莢膜是位于菌體表面的物質(zhì),是決定細(xì)菌表面疏水與自動(dòng)聚集能力強(qiáng)弱的因素之一。為探究wza或wzc基因缺失對(duì)RA表面性質(zhì)的影響,采用碳?xì)浠衔镳ぶy(cè)定了表面疏水性、沉降法測(cè)定自凝集能力、試管和96孔板培養(yǎng)后結(jié)晶紫染色進(jìn)行生物膜定性和定量測(cè)定。結(jié)果表明:(1)RA CH-1Δwza株的表面疏水性(26.10%)及RA CH-1Δwzc株的表面疏水性(27.59%)較RA CH-1株的表面疏水性(14.36%)顯著提高(p0.001),表明wza或wzc基因的缺失影響了具有很好的親水性的莢膜多糖的輸出,從而導(dǎo)致表面疏水性的增強(qiáng);(2)經(jīng)過12 h沉降,RA CH-1Δwza株及RA CH-1Δwzc株的OD_(600)值分別為0.20和0.21,而RA CH-1株OD_(600)值為0.90,表明wza或wzc基因缺失后自動(dòng)凝集能力顯著提高(p0.001);(3)試管和96孔板氣液交界的培養(yǎng)物,wza、wzc和wzac基因缺失株經(jīng)過結(jié)晶紫染色后能夠清楚地觀察到形成的生物膜,而野生株、回補(bǔ)株無明顯生物膜形成,測(cè)定OD_(595)值分析表明wza或wzc基因缺失后RA的生物膜形成能力顯著增強(qiáng)(p0.001)。3.wza或wzc基因缺失對(duì)RA致病力的影響細(xì)胞黏附與入侵能力、半數(shù)致死量(LD_(50))、致感染宿主發(fā)病及組織損傷和病變的能力等,是判定細(xì)菌致病力的重要指標(biāo)。對(duì)wza、wzc和wzac基因缺失后RA的這些指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明:(1)對(duì)Vero細(xì)胞的黏附細(xì)菌數(shù)、入侵細(xì)菌數(shù)均顯著(p0.001)高于野生株,表明黏附和入侵能力增強(qiáng):(2)感染7日齡雛鴨后,RA CH-1Δwza株(LD_(50)為1.99×10~100 CFU)及RA CH-1Δwzc株LD_(50)為1.26×10~100 CFU),分別較野生株(LD_(50)為7.94×10~7 CFU)毒力分別下降250倍和159倍;(3)感染7日齡雛鴨后1d、3d和5d的血液中均分離不到相應(yīng)缺失株,而野生株的血液載菌量達(dá)到10~6-10~8 CFU/mL;(4)感染7日齡雛鴨,野生株感染后的雛鴨的肝索結(jié)構(gòu)紊亂、肝細(xì)胞壞死、腫脹、細(xì)胞核濃縮,并出現(xiàn)彌漫性脂肪變性,心臟心外膜增厚水腫、表面有纖維素滲出物,腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管明顯擴(kuò)張充血、其間可見炎性細(xì)胞彌散性浸潤、血管周圍可見淋巴細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞形成的“管套”現(xiàn)象,而各缺失株感染后的雛鴨的肝、腦、心臟組織病變不明顯,表明對(duì)雛鴨致致病變能力顯著下降;(5)在50%正常鴨血清中不能存活。當(dāng)wza、wzc基因回補(bǔ)后,以上特性可恢復(fù)至野生株水平。因此,wza和wzc基因缺失后,RA對(duì)Vero細(xì)胞的黏附與入侵的能力均顯著增強(qiáng),但感染鴨后更容易被宿主介導(dǎo)的補(bǔ)體殺傷,對(duì)宿主鴨的致病能力減弱。4.Wzc蛋白的酪氨酸磷酸化及Wzc與Wza互作初探構(gòu)建的截短pET-28a(+)-Wzc E521-F765和pET-28a(+)-Wzc E521-F790表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入至轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)后,結(jié)果證實(shí)均為可溶性表達(dá)。其中,Wzc E521-F765為不含C端酪氨酸富集區(qū)的片段,不能被特異性磷酸化酪氨酸單克隆抗體4G10所識(shí)別;Wzc E521-F790為含有C端酪氨酸富集區(qū)的片段,能被特異性磷酸化酪氨酸單克隆抗體4G10所識(shí)別,因此,Wzc磷酸化位點(diǎn)均位于C端酪氨酸富集區(qū)域�；瘜W(xué)交聯(lián)法證實(shí),Wza和Wzc能發(fā)生相互作用。綜上:RA wza及wzc基因缺失影響了莢膜的輸出和細(xì)菌的生長,導(dǎo)致表面疏水性、自凝集能力、生物膜形成能力增強(qiáng),降低了致病性,Wzc蛋白C端酪氨酸富集區(qū)域是主要的磷酸化位點(diǎn),Wzc與Wza發(fā)生相互作用參與莢膜多糖的合成與輸出。
【圖文】：

EPS）[66]。這三種多糖在細(xì)菌細(xì)胞表面的分布見圖1-2所示。CPS由1-6個(gè)單糖組成的重復(fù)單元通過糖苷鍵連接起來形成，在細(xì)菌表面形成多糖層[67-69]。LPS由2-8個(gè)寡糖重復(fù)單元連接到脂質(zhì)A上錨定在細(xì)胞外膜上[70-73]。EPS則是一些未粘附在細(xì)菌表面的分泌糖原[43, 74]。細(xì)菌表面多糖的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)需要一些酶參與，比如外膜多糖輸出蛋白、多糖共聚酶蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶等。3.2 革蘭陰性菌 CPS、LPS 和 EPS 的組裝機(jī)制細(xì)菌表面多糖組裝及合成機(jī)制主要分為4種，包括依賴Wzx /Wzy合成途徑、依賴ABC轉(zhuǎn)座子合成途徑、合酶合成途徑、胞外蔗糖酶合成途徑[75, 76]。依賴Wzx /Wzy合成途徑是最主要的表面多糖合成機(jī)制，，參與多種多糖的組裝。依賴ABC轉(zhuǎn)座子合成途徑主要涉及細(xì)菌CPS的合成。合酶合成途徑及胞外蔗糖酶合成途徑主要在革蘭氏陽性菌EPS的合成中發(fā)揮作用，其機(jī)制不是很清楚。依賴Wzx/Wzy合成途徑需要Wzx、Wzy和其他蛋白的參與。此合成途徑的CPS中主要包括如下幾類功能的基因：?jiǎn)翁呛铣擅富颉⒄{(diào)節(jié)基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GTs）、寡糖重復(fù)單位聚合酶基因（wzy）、翻轉(zhuǎn)酶基因（wzx）以及一些修飾基因（如乙酰轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶基因等）[77]。大腸桿菌1群莢膜的合成通過依賴Wzx /Wzy途徑如圖1-3所示。起始階段：位于胞質(zhì)內(nèi)糖核苷將糖基磷酸轉(zhuǎn)移到十一碳二烯磷酸酯（undecaprenyl phosphate，Und-p）上形成Und-pp連接的糖鏈；延伸-轉(zhuǎn)位-聚合階段：起始反應(yīng)后，在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下將不同的單糖殘基依次添加到Und-PP-糖鏈上形成Und-PP-重復(fù)單元

圖 1-3 CPS 組裝和輸出通路原理圖依賴ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通路（紫色區(qū)域）和依賴Wzx/Wzy合成途徑（綠色區(qū)域）。Fig.1-3 Schematic representation of the CPS assembly and export pathwaysABC-dependent pathway (purple region) and Wzy-dependent pathway (green region).
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：2591734