【摘要】：本論文從以下兩個(gè)方面對(duì)重組蓖麻毒素A鏈與天然蓖麻毒素免疫效果進(jìn)行了比較分析研究。1.制備具有生物活性的重組蓖麻毒素A鏈(r-RTA)并與天然蓖麻毒素(n-RT)進(jìn)行毒性比較。根據(jù)NCBI公布的RTA序列合成基因片段,并將其克隆于pET-28a載體后,利用大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá),鎳柱親和層析純化上清,500 mmol/L咪唑溶液洗脫獲得可溶性r-RTA蛋白,通過(guò)SDS-PAGE及Western blotting對(duì)其進(jìn)行鑒定并用ELISA測(cè)定其免疫原性后,對(duì)r-RTA與n-RT進(jìn)行動(dòng)物和細(xì)胞試驗(yàn)毒性比較研究。結(jié)果顯示,該r-RTA在上清中表達(dá)率為31.2%;每升細(xì)菌培養(yǎng)物純化后可得20mg目的蛋白,純度≥90%,大小為32kD。其免疫原性約為天然RT的1.27倍;通過(guò)獲取的n-RT細(xì)胞半抑制濃度(IC50為0.01μg/mL)及動(dòng)物半數(shù)致死量(LD50為3.27±0.44μg/kg),以相同濃度進(jìn)行細(xì)胞感染和動(dòng)物攻毒試驗(yàn),結(jié)果顯示,同等劑量下,在細(xì)胞試驗(yàn)中,n-RT毒力是r-RTA的2700倍;在動(dòng)物試驗(yàn)中,n-RT組對(duì)動(dòng)物致死率為40%,r-RTA組動(dòng)物無(wú)死亡。結(jié)果表明,單獨(dú)RTA,在沒(méi)有RTB協(xié)助下,具有一定的毒性作用,但毒力將顯著降低。2.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了重組蓖麻毒素A鏈(r-RTA)、重組突變蓖麻毒素A鏈(m-RTA)和天然蓖麻毒素(n-RT)毒力及免疫效果分析。細(xì)胞試驗(yàn)中,n-RT毒力約是m-RTA與r-RTA的2700倍。腹腔注射免疫無(wú)佐劑的r-RTA、m-RTA和n-RT,免疫過(guò)程中小鼠體重均有所減輕,相較于r-RTA組和n-RT組,m-RTA組小鼠體重變化最小。4次免疫以后血清抗體效價(jià)均達(dá)到10-4以上,以6000μg/kg m-RTA免疫小鼠可對(duì)20×LD50劑量蓖麻毒素提供完全保護(hù)。該結(jié)果表明r-RTA、m-RTA和n-RT對(duì)小鼠均有一定毒性,m-RTA刺激小對(duì)免疫鼠能提供更好的保護(hù)。該研究結(jié)果將為開(kāi)發(fā)基于RTA的蓖麻毒素疫苗提供重要數(shù)據(jù)和理論支撐。
【圖文】：

72h LD50測(cè)定小鼠 100%和 0%的死亡率為最大劑量和最小劑量，以定攻毒劑量（2μg/kg、2.5μg/kg、2.9μg/kg、3.5μg/kg、40 只。腹腔注射天然蓖麻毒素，注射當(dāng)天為 D0，觀察ΣP-0.5）計(jì)算 LD50[48]。LB/c 小鼠分為 3 組（r-RTA 組、n-RT 組和對(duì)照組），每 LD50為攻毒劑量，，腹腔注射同等劑量 r-RTA、n-RT 和、體重變化、臨床發(fā)病情況及組織病理分析。鑒定目的片段大小為 821bp，與預(yù)期結(jié)果相符。其測(cè)序結(jié)表明成功構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒。

圖 1.1(B)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定ouble digestion identification of recomoⅠ+BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物；M，DLtion of recombinant cloning plasmid; 表達(dá)及表達(dá)量分析mol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng) 4 h，約為 32kD，與預(yù)期的蛋白大小量為總蛋白的 31.2%（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4

【共引文獻(xiàn)】

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3 曲英龍;錢愛(ài)東;錢軍;計(jì)越;鄭關(guān)雨;郭振東;趙思言;付瑩瑩;張毅;趙紅艷;陳龍;劉林娜;;重組蓖麻毒素A鏈表達(dá)及其與天然蓖麻毒素毒性比較研究[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2015年04期

4 蘇雅拉圖;黃鳳蘭;張繼星;李國(guó)瑞;呼和;吳俊華;;蓖麻毒蛋白的研究進(jìn)展[J];內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年04期

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7 郝苗;利用志賀毒素B亞基融合蛋白研究其胞內(nèi)運(yùn)輸[D];東北師范大學(xué);2010年

8 李箐;產(chǎn)氣莢膜梭菌α、ε毒素突變體構(gòu)建及應(yīng)用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

9 孔祥波;蓖麻堿高效降解菌選育及混菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[D];天津科技大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2587262