【摘要】：哺乳動物的繁殖能力受多種因素的影響,動物個體本身的衰老和生殖細(xì)胞的老化嚴(yán)重影響動物的繁殖效率,而其中卵母細(xì)胞的老化嚴(yán)重降低了雌性動物的繁殖能力。受各種原因的影響,卵母細(xì)胞會發(fā)生不同程度的老化,這不僅造成體內(nèi)外受精率降低,胚胎質(zhì)量低下,早期妊娠流產(chǎn)可能性增加,后代發(fā)育異常等問題,而且限制了體外受精(IVF)、體細(xì)胞核移植(SCNT)及胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)等技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛應(yīng)用。因此研究卵母細(xì)胞老化及調(diào)控機(jī)制顯得尤為重要。α-硫辛酸(a-lipoic acid)是種存在于線粒體內(nèi)的生物抗氧化劑,幾乎對所有自由基均有清除作用。本研究以小鼠卵母細(xì)胞為材料,在研究卵母細(xì)胞老化進(jìn)程的基礎(chǔ)上,通過體外添加α-硫辛酸(LA),采用體外受精、孤雌激活、免疫熒光等技術(shù),研究其在卵母細(xì)胞體外老化過程中的作用,同時探討α-硫辛酸和自噬在抗老化過程中的作用和聯(lián)系。1、α-硫辛酸延緩卵母細(xì)胞的體外老化進(jìn)程在卵母細(xì)胞的體外老化過程中,體外受精率顯著下降,由老化前的87.71%±6.35%下降至67.55%±6.44%,同時受精后的細(xì)胞異常率升高,由老化前的2.05%土2.12%升高至12.85%±4.20%,細(xì)胞極性丟失(肌動蛋白帽丟失),紡錘體形態(tài)發(fā)生異常,組蛋白H4K8和H4K12乙酰化水平升高。在卵母細(xì)胞體外老化過程中添加10μmol/L的α-硫辛酸后,與未添加組(正常老化)相比,卵母細(xì)胞的體外受精率升高至83.19%±8.00%；受精后的異常率下降至4.46%±2.07%,紡錘體形態(tài)趨于正常,細(xì)胞極性尚存,組蛋白H4K8和H4K12乙�；捷^低。結(jié)果表明α-硫辛酸可以延緩卵母細(xì)胞的體外老化進(jìn)程。2、α-硫辛酸抑制體外老化卵母細(xì)胞中自噬水平的升高首先,檢測了卵母細(xì)胞體外老化過程中的自噬水平。結(jié)果表明,在卵母細(xì)胞體外老化10h內(nèi),自噬水平呈逐漸升高的趨勢。其次,添加自噬增強(qiáng)劑(Rapa)或自噬抑制劑(3-MA)來為干擾自噬水平后,檢測卵母細(xì)胞老化進(jìn)程。結(jié)果顯示,與未處理組相比添加Rapa后,卵母細(xì)胞的體外受精率極顯著降低(p0.01),受精后的異常率顯著升高(p0.05)；與此相反的,用3-MA處理后,卵母細(xì)胞的體外受精率升高(p0.05),受精后的異常率則顯著下降(p0.05)。最后,在卵母細(xì)胞體外老化過程中添加α-硫辛酸后,檢測老化卵母細(xì)胞的自噬水平,結(jié)果表明自噬水平受α-硫辛酸的影響出現(xiàn)了下降。這說明卵母細(xì)胞在體外老化過程自噬水平會出現(xiàn)升高,而α-硫辛酸可以抑制其升高的程度,α-硫辛酸可能通過抑制自噬水平的升高來延緩卵母細(xì)胞的老化。綜上所述,α-硫辛酸通過提高體外受精率、抑制細(xì)胞極性的丟失、抑制組蛋白修飾水平和自噬水平的升高來延緩卵母細(xì)胞的老化進(jìn)程。
【圖文】：

２．２邋ａ－硫辛酸維持體外老化卵母細(xì)胞紡淫體的正常形態(tài)逡逑Ｏｈ時采集的新鮮卵母細(xì)胞，此時卵母細(xì)胞并未發(fā)生老化，紡纏體結(jié)構(gòu)大部分呈正常形逡逑態(tài)，很少發(fā)生異常。如下圖２所示化組紡鍵體兩頭略尖，結(jié)構(gòu)分明，形態(tài)正常，染色體逡逑整齊的排列在紡鍵體中間；老化ｌＯｈ后盡管紡搤體整體結(jié)構(gòu)完整，染色體同樣排列規(guī)整，逡逑但形態(tài)發(fā)生了輕微的改變，與化時相比此時紡鍵體兩頭}圓，略成＂圓桶＂形；添加（Ｘ－逡逑硫辛酸后，結(jié)構(gòu)形態(tài)與化時相仿，無明囼差異；與１化相比，明顯形態(tài)恢復(fù)正常，改變逡逑了其＂圓桶＂形結(jié)構(gòu)。說明了邋ａ－硫辛酸可Ｗ抑制因老化而造成的紡錐體形態(tài)的改變。逡逑

ｐｒｏｂｅ；邋ＤＮＡ，，邋ｂｌｕｅ，邋ＤＡＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋．邋（４0ｘ）逡逑２．３邋ａ－硫辛酸抑制體外老化卵母細(xì)胞肌動蛋白帽的丟失逡逑（Ｘ－硫辛酸對體外老化卵母細(xì)胞肌動蛋白帽的影響見圖３。Ａ圖中化時，可觀察到肌逡逑動蛋白帽緊貼紡錐體一側(cè)分布；老化１化后，紡鏈體一側(cè)肌動蛋白帽消失；添加ａ－硫辛酸逡逑后，明雖要優(yōu)于老化ｌＯｈ組肌動蛋白帽恢復(fù)，同樣緊貼紡堘體分布。同時巧光統(tǒng)計圖也驗(yàn)逡逑證了這一結(jié)果。Ｂ圖為沿Ａ圖白線區(qū)域的巧光統(tǒng)計圖，從圖中可｜＾１看出，化時紅色巧光強(qiáng)逡逑度較強(qiáng)，老化ｌＯｈ后紅色巧光幾乎消失，添加ａ－硫辛酸后，紅色巧光明顯強(qiáng)于老化１化組。逡逑說明ａ－硫辛酸可＾心改善因老化而造成的卵母細(xì)胞肌動蛋白帽的丟失。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S814

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本文編號：2582879