【摘要】：水貂出血性肺炎是由銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.a）引起的一種急性、致死性傳染病，主要在夏秋季節(jié)暴發(fā)，各個(gè)年齡段的水貂均易感染，發(fā)病率和病死率很高，與水貂病毒性腸炎和水貂犬瘟熱一起成為危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的三大傳染病。 本實(shí)驗(yàn)從2012年在山東和遼寧地區(qū)暴發(fā)水貂出血性肺炎的疑似病例中，根據(jù)分離株的生長(zhǎng)特性、生理生化代謝特點(diǎn)以及分子生物學(xué)特征，分離鑒定了22株銅綠假單胞菌毒株。并對(duì)分離株進(jìn)行了DNA隨機(jī)多態(tài)性分析和藥敏試驗(yàn)，，分析了分離株之間的親緣關(guān)系以及分離株對(duì)當(dāng)前常用治療藥物的敏感性情況。 銅綠假單胞菌外膜蛋白F（OprF）在不同血清型的毒株之間高度保守，而且具有很好的免疫原性，是保護(hù)性抗原。因此，本研究從患出血性肺炎的病死水貂中分離鑒定得到的銅綠假單胞菌中，通過PCR擴(kuò)增出OprF基因片段，將該基因克隆到pMD18-T載體進(jìn)行了測(cè)序。將測(cè)序正確的目的基因連接到表達(dá)載體pET-28a后轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21中，通過IPTG誘導(dǎo)、超聲裂解、鎳柱純化、SDS-PAGE電泳分析和Western-blot鑒定得到了大量表達(dá)的外膜蛋白OprF，為下一步間接ELISA方法的建立打下了基礎(chǔ)。 利用純化的蛋白OprF，對(duì)建立間接ELISA方法的條件進(jìn)行了篩選，確定了間接ELISA外膜蛋白OprF的最佳包被濃度為2μg/mL和血清的最佳稀釋倍數(shù)為1:4，其他與常規(guī)條件相同。篩選出該ELISA檢測(cè)方法的陽性臨界值為0.06，最低檢出量為1:256，組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)在0.33%～8.27%，組間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)在1.24%～5.59%，均小于10%，表明該方法具有良好的重復(fù)穩(wěn)定性。建立的ELISA檢測(cè)方法具有良好的特異性，對(duì)本實(shí)驗(yàn)保存的其他病原體陽性血清：水貂大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和肺炎克雷伯菌均為陰性。用已經(jīng)建立的間接ELISA方法檢測(cè)已知的30份陽性血清，28份為陽性，符合率為93.3%。該方法可以準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)出水貂體內(nèi)各種銅綠假單胞菌血清型的抗體水平，具有應(yīng)用價(jià)值。 本研究從選用銅綠假單胞菌的當(dāng)前主要流行血清型G、B型和肺炎克雷伯菌K1型3種菌株制備成滅活疫苗。免疫了以10%滅活肺炎克雷伯菌為佐劑的疫苗，保護(hù)率為83%；免疫了以10%Al(OH)3佐劑的疫苗，保護(hù)率為71%；而作為空白對(duì)照組，僅注射了生理鹽水的第6組小鼠的存活率為33%。相對(duì)于傳統(tǒng)的Al(OH)3佐劑，肺炎克雷伯菌本身可以作為疫苗成分，保護(hù)機(jī)體免于該病原菌的感染，同時(shí)又兼有良好的免疫調(diào)節(jié)活性，加強(qiáng)了機(jī)體對(duì)銅綠假單胞菌的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生了更高的抗體水平和提供了更好的免疫保護(hù)，獸醫(yī)臨床具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

篇 研究?jī)?nèi)容 第 1 章貂源綠膿桿菌的分離鑒定及生物學(xué)。培養(yǎng)特性 株菌可以在十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)齊或者呈波浪狀的菌落。產(chǎn)色素的細(xì)菌培養(yǎng)基氣味。其中呈藍(lán)綠色菌落的有 1 株（5%），呈紅褐色菌落的有 7 株（33%），不產(chǎn)色素菌落的有均為革蘭氏陰性小桿菌，單個(gè)散在或成對(duì)出現(xiàn)

le1.1 Biochemical characteristics of the 22 st 陽性菌數(shù)甲基溴化銨培養(yǎng)基生長(zhǎng) 22（100%）斜面培養(yǎng)基 42℃生長(zhǎng) 22（100%）養(yǎng)基生長(zhǎng) 22（100%）白胨水還原 22（100%）測(cè)定 19（90%） 21（95%）22（100%） PCR 鑒定胞菌 16S rRNA 保守序列 PCR 檢測(cè)，所有 22 株擴(kuò)增出目的條帶，多擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并在離菌株與銅綠假單胞菌同源性為 99.9%，因此可
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.92

【參考文獻(xiàn)】

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1 高玉偉;夏咸柱;胡桂學(xué);黃耕;王鐵成;魏玉榮;;細(xì)菌分離與基因擴(kuò)增確診水貂出血性肺炎[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2006年04期

2 許小敏,張民權(quán),廖萍華;123株綠膿桿菌的抗菌藥物耐藥性和耐藥質(zhì)粒檢測(cè)[J];寧波醫(yī)學(xué);1999年03期

3 劉德福,趙燕,劉超;水貂暴發(fā)出血性肺炎的診治報(bào)告[J];畜牧獸醫(yī)雜志;2003年04期

4 龐雪云;冼中任;田碧文;孫蕾;李強(qiáng);黃憲章;;多黏菌素B對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌體外藥物敏感試驗(yàn)分析[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2006年12期

5 徐修禮,孫怡群,樊新,徐焰;頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南對(duì)銅綠假單胞菌體外抗菌活性[J];中國(guó)抗生素雜志;2004年02期

6 崔紅英,王健誠(chéng),吳秀友;水貂出血性肺炎的診治[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2002年07期

7 任橋;李麗;鄒本革;劉煥奇;張啟迪;徐麗;畢可東;;水貂出血性肺炎的診治[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘;2012年02期

8 李國(guó)華;史秋梅;;水貂出血性肺炎的診治[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2010年07期

本文編號(hào)：2582258