【摘要】：傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的3到12周齡雛雞和青年雞的一種急性、高度接觸性傳染病。IBDV主要侵害法氏囊B淋巴細(xì)胞而引起患病雞的免疫抑制,給養(yǎng)禽業(yè)造成很大的的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和宿主保護(hù)性抗原,也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)基因。本試驗(yàn)構(gòu)建了7個帶有不同標(biāo)簽的VP2-LS3(lumazine synthase,LS3)重組原核表達(dá)載體,以期在大腸桿菌中表達(dá)出高可溶性的VP2-LS3重組蛋白。檢測結(jié)果顯示表達(dá)的VP2-LS3重組蛋白具有良好的免疫原性,鏡檢顯示形成了LS3蛋白籠。本試驗(yàn)為IBDV基因工程亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。首先,本試驗(yàn)對7種融合標(biāo)簽的基因序列進(jìn)行分析,設(shè)計Nde I和Bam HI兩個酶切位點(diǎn)用于擴(kuò)增7種融合標(biāo)簽的核苷酸序列(His6-Grifin-TEV、His6-GST-TEV、His6-MBP-TEV、His6-Nus A-TEV His6-γ-crystallin-TEV、His6-Ars C-TEV和His6-Ppi B-TEV)。將7種標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與p MD19-T載體連接轉(zhuǎn)化,經(jīng)菌液PCR及測序分析鑒定正確后,把正確的7種標(biāo)簽的線性片段和VP2-LS3目的基因與表達(dá)載體p ET-21b連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后跑SDS-PAGE電泳分析融合不同標(biāo)簽的VP2-LS3蛋白的表達(dá)量和可溶性。篩選出對VP2-LS3蛋白可溶性表達(dá)水平較高的融合標(biāo)簽,并進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示:除了Ppi B標(biāo)簽,其它標(biāo)簽都不同程度地促進(jìn)了VP2-LS3蛋白的可溶性表達(dá),其中MBP標(biāo)簽效果最好,可溶性表達(dá)水平達(dá)到69.5%。其次,利用Ni-NTA Agarose親和純化VP2-LS3重組蛋白并用TEV酶酶切獲取VP2-LS3蛋白。電鏡觀察分析VP2-LS3重組蛋白是否形成蛋白籠納米顆粒。試驗(yàn)結(jié)果顯示TEV酶可以把His6-MBP標(biāo)簽蛋白與VP2-LS3蛋白分開,獲得了高純度的VP2-LS3蛋白;鏡檢顯示形成了LS3蛋白籠納米顆粒。最后,將純化的VP2-LS3重組蛋白與等體積的佐劑乳化,制備基因工程亞單位疫苗免疫家兔,獲得兔抗VP2的血清,并對其進(jìn)行Western blot和間接ELISA分析。Western blot分析結(jié)果表明表達(dá)的VP2蛋白可與IBDV陽性血清發(fā)生反應(yīng),而不與陰性對照血清發(fā)生反應(yīng)。間接ELISA檢測結(jié)果顯示制備的兔抗VP2血清效價達(dá)到1:12 800。以上試驗(yàn)結(jié)果表明體外形成的LS3蛋白籠可以包裹VP2蛋白,而且合成的VP2-LS3重組蛋白具有良好的免疫原性,為IBDV基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

因的 PCR 擴(kuò)增的可溶性表達(dá)，在構(gòu)建的 VP2-LS3 基因載體的 Nin、MBP、γ-crystallin、ArsC、 PpiB、NusA)，在融TEV 蛋白酶識別位點(diǎn)，方便后續(xù)標(biāo)簽蛋白的去除，，氨酸標(biāo)簽 His6-Tag (圖 1)。

圖 1 研究中構(gòu)建的表達(dá)載體Fig. 1 Construction of the expression vectors used in this study建的 7 種質(zhì)粒為模板擴(kuò)增 His6至 TEV 包含融合標(biāo)簽糖凝膠電泳鑒定，每個標(biāo)簽的片段大小與預(yù)期相符合序后比對正確。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：2582074