【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起斷乳豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等多種疾病的主要病原體,病毒的主要衣殼蛋白Cap在體外可自組裝成病毒樣顆粒。研究表明Cap蛋白與補(bǔ)體蛋白C1q膜受體gC1qR、動(dòng)力蛋白輕鏈DYNLL1等蛋白存在相互作用,影響病毒復(fù)制及細(xì)胞功能。關(guān)于Cap蛋白互作蛋白的研究有助于了解PCV2感染的分子機(jī)制。因此對PCV2病毒的Cap蛋白的互作蛋白的研究具有重要意義。根據(jù)GenBank中PCV2基因序列,設(shè)計(jì)cap基因特異性引物,PCR擴(kuò)增該基因,構(gòu)建重組Cap蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Cap,大量誘導(dǎo)表達(dá)、純化重組蛋白,免疫新西蘭大白兔,獲得Cap蛋白的多克隆抗體。設(shè)計(jì)一對包含attB重組位點(diǎn)的cap基因特異性引物,PCR擴(kuò)增獲得帶有attB1和attB2位點(diǎn)的cap基因片段,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建真核穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒pDEST-SFB-Cap,轉(zhuǎn)染PK-15豬腎細(xì)胞,利用嘌呤霉素篩選,獲得攜帶SFB標(biāo)簽的穩(wěn)定表達(dá)重組Cap蛋白的PK-15細(xì)胞株。免疫共沉淀和Western bolt檢測到重組Cap蛋白的表達(dá)。間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)重組Cap蛋白在部分細(xì)胞內(nèi)呈點(diǎn)狀熒光分布,可能形成病毒性顆粒;流式細(xì)胞儀檢測表明Cap蛋白的表達(dá)可誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞凋亡。本研究成功獲得Cap蛋白的多克隆抗體和建立攜帶SFB標(biāo)簽的Cap蛋白的穩(wěn)定表達(dá)PK-15細(xì)胞株,為下一步通過串聯(lián)親合純化/質(zhì)譜方法鑒定Cap蛋白的互作蛋白研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

PCR鑒定

圖 3-2 pET-28a-Cap 酶切鑒定凝膠電泳fication of digestion of pET-28a-Cap by 對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL5000；1：對照；2：0 DNAmarker, 1: control, 2: digestion of p純化 BL-21 感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá) Cap DS-PAGE 凝膠電泳檢測，圖 3-3 顯表達(dá)，目的蛋白在 30kDa 處。大量 Cap 蛋白，結(jié)果見圖 3-4，將純化蛋的 PCV2 Cap 蛋白特異性抗體，，與，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn) Cap 蛋白檢測。
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651

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本文編號：2581062