【摘要】：為探討骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)對體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)分化的影響以及Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,本文采用25 ng/mL M-CSF和30 ng/mL RANKL體外聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化為OC。在培養(yǎng)過程中添加不同濃度的OPG(0、20、40、80 ng/mL),作用24h,利用TRAP染色觀察OC分化過程中的形態(tài)學(xué)變化、骨吸收陷窩檢測細(xì)胞的骨吸收活性、免疫熒光檢測F-actin環(huán)的形成,掃描電鏡觀察偽足的變化,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,QRT-PCR)檢測TRAP、 Cathepsin K、dc42V1、Cdc42V2、Rac1、Rac2、Rac3基因的變化,以及免疫印跡(western blot)檢測TRAP、Cathepsin K、PAK1、PAK2、PAK3、LIMK、cofilin相關(guān)信號蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明：①用25 ng/mL M-CSF及30 ng/mL RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成OC過程中,與OC分化和骨吸收相關(guān)的TRAP、Cathepsin K基因及蛋白的表達(dá)均顯著或極顯著上升(P0.05或P0.01)；②OC分化的第3d,加入OPG處理24 h后,能極顯著減少OC的數(shù)目及骨吸收陷窩面積(P0.01),并且極顯著降低與OC分化和骨吸收相關(guān)的TRAP、Cathepsin K蛋白的表達(dá)(P0.01)；③OPG可以抑制OC的F-actin環(huán)的形成,OPG處理組細(xì)胞偽足小體(pseudopodia corpuscle)的聚合能力降低,排布散亂,肌動蛋白環(huán)(filamentous-actin rings, F-actin rings)、絲狀偽足(filopodia)和板狀偽足(lamellipodia)數(shù)量減少；④OPG可顯著或極顯著降低OC分化過程中Rho家族的Cdc42V1、Cdc42V2、 Rac2、Rac3基因的表達(dá)(P0.05或P0.01),并且顯著或極顯著降低Rho通路相關(guān)蛋白PAK1的Ser144和Thr423位點(diǎn)、PAK2的Ser141和Thr402位點(diǎn)、LIMK1的Thr508位點(diǎn)、LIMK2的Thr505位點(diǎn)的磷酸化水平(P0.05或P0.01),顯著或極顯著增加cofilin的磷酸化水平(P0.05或P0.01),且隨OPG濃度的升高抑制或增加的作用更加明顯。結(jié)論：OPG能夠抑制OC的分化,降低OC的骨吸收活性,并且Rho信號通路參與了OPG抑制OC的分化過程；OPG能夠通過抑制Rho家族基因Cdc42V1、Cdc42V2、Rac2、Rac3的表達(dá),下調(diào)下游靶蛋白PAK的表達(dá),降低LIMK的磷酸化水平,從而上調(diào)cofilin的磷酸化,最終抑制OC的分化成熟。
【圖文】：

圖１－１－２破骨細(xì)胞的偽足逡逑（Ａ）小鼠破骨細(xì)胞的肌動蛋白絲羅丹明染色（２0ｘ－＾４0ｘ）逡逑（Ｂ）破骨細(xì)胞偽足的形成單個(gè)偽足的形成巧偽足叢的形成餅封巧帶的形成（４）肌動蛋白環(huán)的逡逑形成逡逑

圖２－１－２體外培養(yǎng)各時(shí)間段破骨細(xì)胞ＴＲＡＰ染色（１００Ｘ）逡逑－１－２邋ＴＲＡＰ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｎ邋ｅａｃｈ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔ邋ｏｆ邋ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ邋扣邋ｖｚＹｒｏ邋（Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋】０0ｘ）逡逑細(xì)胞分化過程中標(biāo)志性蛋白ＴＲＡＰ、ＣａｔｈｅｐｓｉｎＫ的表達(dá)逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2

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本文編號：2580945