【摘要】：為探討骨保護素(osteoprotegerin,OPG)對體外培養(yǎng)破骨細胞(osteoclast,OC)分化的影響以及Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,本文采用25 ng/mL M-CSF和30 ng/mL RANKL體外聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細胞分化為OC。在培養(yǎng)過程中添加不同濃度的OPG(0、20、40、80 ng/mL),作用24h,利用TRAP染色觀察OC分化過程中的形態(tài)學(xué)變化、骨吸收陷窩檢測細胞的骨吸收活性、免疫熒光檢測F-actin環(huán)的形成,掃描電鏡觀察偽足的變化,實時熒光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,QRT-PCR)檢測TRAP、 Cathepsin K、dc42V1、Cdc42V2、Rac1、Rac2、Rac3基因的變化,以及免疫印跡(western blot)檢測TRAP、Cathepsin K、PAK1、PAK2、PAK3、LIMK、cofilin相關(guān)信號蛋白的表達。結(jié)果表明：①用25 ng/mL M-CSF及30 ng/mL RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細胞形成OC過程中,與OC分化和骨吸收相關(guān)的TRAP、Cathepsin K基因及蛋白的表達均顯著或極顯著上升(P0.05或P0.01)；②OC分化的第3d,加入OPG處理24 h后,能極顯著減少OC的數(shù)目及骨吸收陷窩面積(P0.01),并且極顯著降低與OC分化和骨吸收相關(guān)的TRAP、Cathepsin K蛋白的表達(P0.01)；③OPG可以抑制OC的F-actin環(huán)的形成,OPG處理組細胞偽足小體(pseudopodia corpuscle)的聚合能力降低,排布散亂,肌動蛋白環(huán)(filamentous-actin rings, F-actin rings)、絲狀偽足(filopodia)和板狀偽足(lamellipodia)數(shù)量減少；④OPG可顯著或極顯著降低OC分化過程中Rho家族的Cdc42V1、Cdc42V2、 Rac2、Rac3基因的表達(P0.05或P0.01),并且顯著或極顯著降低Rho通路相關(guān)蛋白PAK1的Ser144和Thr423位點、PAK2的Ser141和Thr402位點、LIMK1的Thr508位點、LIMK2的Thr505位點的磷酸化水平(P0.05或P0.01),顯著或極顯著增加cofilin的磷酸化水平(P0.05或P0.01),且隨OPG濃度的升高抑制或增加的作用更加明顯。結(jié)論：OPG能夠抑制OC的分化,降低OC的骨吸收活性,并且Rho信號通路參與了OPG抑制OC的分化過程；OPG能夠通過抑制Rho家族基因Cdc42V1、Cdc42V2、Rac2、Rac3的表達,下調(diào)下游靶蛋白PAK的表達,降低LIMK的磷酸化水平,從而上調(diào)cofilin的磷酸化,最終抑制OC的分化成熟。
【圖文】：

圖１－１－２破骨細胞的偽足逡逑（Ａ）小鼠破骨細胞的肌動蛋白絲羅丹明染色（２0ｘ－＾４0ｘ）逡逑（Ｂ）破骨細胞偽足的形成單個偽足的形成巧偽足叢的形成餅封巧帶的形成（４）肌動蛋白環(huán)的逡逑形成逡逑

圖２－１－２體外培養(yǎng)各時間段破骨細胞ＴＲＡＰ染色（１００Ｘ）逡逑－１－２邋ＴＲＡＰ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｎ邋ｅａｃｈ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔ邋ｏｆ邋ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ邋扣邋ｖｚＹｒｏ邋（Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋】０0ｘ）逡逑細胞分化過程中標(biāo)志性蛋白ＴＲＡＰ、ＣａｔｈｅｐｓｉｎＫ的表達逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2

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本文編號：2580945