【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)引起的以母豬的繁殖障礙與仔豬的呼吸障礙為特征的病毒性傳染病。PRRSV的一個重要生物學(xué)特征是對豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophage,PAM)具有親嗜性。PRRSV特異性中和抗體在抗PRRSV的免疫保護(hù)中具有重要作用,同時也是評估豬群PRRS免疫保護(hù)水平的指標(biāo)。因此建立基于PAMs的抗PRRSV的中和抗體的檢測方法至關(guān)重要,對PRRS的防治具有重要意義。SHP1是肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸磷酸酶,可抑制TLR信號介導(dǎo)的NF-κB和MARK的激活,從而抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。但有研究表明SHP1卻對TLR和RIG-I介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生有激活作用。SHP1可通過相反的方式調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。為了研究SHP1在PRRSV誘導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)中的作用,本論文對PRRSV感染后SHP1介導(dǎo)的信號通路進(jìn)行了初步研究。本試驗(yàn)為建立一種檢測豬血清樣品中PRRSV誘導(dǎo)的中和抗體的方法,先將收集的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行滅活處理,取2倍倍比稀釋后的被檢血清和陰性血清分別與等量病毒液混合,接種到鋪單層的PAM細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48h后,收獲樣品,通過用實(shí)驗(yàn)室建立的熒光定量PCR方法測定收獲樣品的病毒拷貝數(shù)來建立抗PRRSV中和抗體的檢測方法。為了驗(yàn)證此方法,本研究采集了34份臨床樣品進(jìn)行抗PRRSV的中和抗體檢測。結(jié)果顯示,本研究建立并驗(yàn)證了基于PAMs的PRRSV誘導(dǎo)的中和抗體的檢測方法,本方法的特異性、重復(fù)性較好,可用于評估豬群PRRSV的免疫保護(hù)水平。本研究為了進(jìn)一步評估豬群PRRS免疫保護(hù)水平,探討了不同免疫原對PRRSV誘導(dǎo)的中和抗體產(chǎn)生的影響,將28日齡的健康仔豬隨機(jī)分成五組,第一組為弱毒苗免疫組,在0d免疫接種PRRSV CH-1R弱毒苗;第二組為滅活免疫原免疫組,在0d免疫接種PRRSV油乳劑滅活免疫原;第三組為先強(qiáng)毒感染再滅活免疫原免疫組,0d免疫接種PRRSV強(qiáng)毒液,7d后再免疫接種滅活免疫原;第四組為先弱毒感染再滅活免疫原免疫組,0d免疫接種PRRSV CH-1R弱毒株,7d后再免疫接種滅活免疫原;第五組為健康對照組。用實(shí)驗(yàn)一建立的抗PRRSV的中和抗體的方法對試驗(yàn)組進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:第一組在免疫后28d時3頭豬中有兩頭豬的中和效價為1:2,在42的時3頭豬的中和效價分別為1:32,1:4,1:16。第二組在免疫后28d時3頭豬抗PRRSV中和效價均小于1:2,在42的時3頭豬的抗PRRSV的中和效價分別為1:4,1:8,1:8。第三組強(qiáng)毒感染后3頭豬已表現(xiàn)臨床癥狀,再用滅活免疫原免疫,發(fā)現(xiàn)已表現(xiàn)出臨床癥狀的豬只免疫后,病情更加嚴(yán)重,均未產(chǎn)生中和抗體。第四組先弱毒感染再滅活免疫原免疫,免疫后28d時有2頭豬中和效價為1:2,42d時有3頭豬均為1:2。結(jié)果表明單純PRRSV弱毒苗免疫產(chǎn)生中和抗體水平要比PRRSV感染后再用滅活免疫原免疫要高,單純PRRSV油乳劑滅活免疫原免疫產(chǎn)生中和抗體水平要比PRRSV感染后再用滅活免疫原免疫要高,單純PRRSV弱毒苗免疫一次的中和抗體水平要比單純PRRSV油乳劑免疫原免疫一次的要高。推測PRRSV感染后再用滅活免疫原免疫可能會增強(qiáng)病毒在豬體內(nèi)的復(fù)制,抑制中和抗體的產(chǎn)生。因此感染過PRRSV的規(guī)�；i場,不建議使用滅活苗免疫。為了探究SHP1在PRRSV誘導(dǎo)的抗病毒免疫中的作用,本研究采用200個TCID50的PRRSV感染豬肺巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophage,PAM),分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h后收集細(xì)胞及上清,分別設(shè)正常細(xì)胞對照組、聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,poly I:C)刺激對照組、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激對照組。采用ELISA方法檢測PRRSV感染的PAM培養(yǎng)上清中SHP1的蛋白表達(dá)情況。用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的實(shí)時熒光定量PCR方法對PRRSV感染組和各個對照組中PRRSV復(fù)制水平及各組PAM細(xì)胞中IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的m RNA轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示:激活的SHP1對PRRSV感染后PAM中IRF7、NF-k B、IFN-β的轉(zhuǎn)錄有促進(jìn)作用,對IRF3和TRAF6的轉(zhuǎn)錄有抑制作用。用LPS、Poly(I:C)刺激PAM細(xì)胞,在12h、24h、36h、48h均能促進(jìn)IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的m RNA轉(zhuǎn)錄水平。LPS刺激PRRSV感染的PAM細(xì)胞促進(jìn)了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的轉(zhuǎn)錄,Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM細(xì)胞也促進(jìn)了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明激活的SHP1會通過TLR介導(dǎo)的信號通路或未知通路來調(diào)節(jié)PRRSV誘導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)水平。LPS、Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM細(xì)胞會抑制病毒的增殖,增強(qiáng)抗病毒細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

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本文編號：2579846