發(fā)布時間：2020-02-15 15:28

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)引起的以母豬的繁殖障礙與仔豬的呼吸障礙為特征的病毒性傳染病。PRRSV的一個重要生物學特征是對豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophage,PAM)具有親嗜性。PRRSV特異性中和抗體在抗PRRSV的免疫保護中具有重要作用,同時也是評估豬群PRRS免疫保護水平的指標。因此建立基于PAMs的抗PRRSV的中和抗體的檢測方法至關重要,對PRRS的防治具有重要意義。SHP1是肺泡巨噬細胞內的酪氨酸磷酸酶,可抑制TLR信號介導的NF-κB和MARK的激活,從而抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生。但有研究表明SHP1卻對TLR和RIG-I介導的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生有激活作用。SHP1可通過相反的方式調節(jié)促炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。為了研究SHP1在PRRSV誘導的抗病毒免疫反應中的作用,本論文對PRRSV感染后SHP1介導的信號通路進行了初步研究。本試驗為建立一種檢測豬血清樣品中PRRSV誘導的中和抗體的方法,先將收集的標準血清進行滅活處理,取2倍倍比稀釋后的被檢血清和陰性血清分別與等量病毒液混合,接種到鋪單層的PAM細胞,繼續(xù)培養(yǎng)48h后,收獲樣品,通過用實驗室建立的熒光定量PCR方法測定收獲樣品的病毒拷貝數(shù)來建立抗PRRSV中和抗體的檢測方法。為了驗證此方法,本研究采集了34份臨床樣品進行抗PRRSV的中和抗體檢測。結果顯示,本研究建立并驗證了基于PAMs的PRRSV誘導的中和抗體的檢測方法,本方法的特異性、重復性較好,可用于評估豬群PRRSV的免疫保護水平。本研究為了進一步評估豬群PRRS免疫保護水平,探討了不同免疫原對PRRSV誘導的中和抗體產(chǎn)生的影響,將28日齡的健康仔豬隨機分成五組,第一組為弱毒苗免疫組,在0d免疫接種PRRSV CH-1R弱毒苗;第二組為滅活免疫原免疫組,在0d免疫接種PRRSV油乳劑滅活免疫原;第三組為先強毒感染再滅活免疫原免疫組,0d免疫接種PRRSV強毒液,7d后再免疫接種滅活免疫原;第四組為先弱毒感染再滅活免疫原免疫組,0d免疫接種PRRSV CH-1R弱毒株,7d后再免疫接種滅活免疫原;第五組為健康對照組。用實驗一建立的抗PRRSV的中和抗體的方法對試驗組進行檢測。結果顯示:第一組在免疫后28d時3頭豬中有兩頭豬的中和效價為1:2,在42的時3頭豬的中和效價分別為1:32,1:4,1:16。第二組在免疫后28d時3頭豬抗PRRSV中和效價均小于1:2,在42的時3頭豬的抗PRRSV的中和效價分別為1:4,1:8,1:8。第三組強毒感染后3頭豬已表現(xiàn)臨床癥狀,再用滅活免疫原免疫,發(fā)現(xiàn)已表現(xiàn)出臨床癥狀的豬只免疫后,病情更加嚴重,均未產(chǎn)生中和抗體。第四組先弱毒感染再滅活免疫原免疫,免疫后28d時有2頭豬中和效價為1:2,42d時有3頭豬均為1:2。結果表明單純PRRSV弱毒苗免疫產(chǎn)生中和抗體水平要比PRRSV感染后再用滅活免疫原免疫要高,單純PRRSV油乳劑滅活免疫原免疫產(chǎn)生中和抗體水平要比PRRSV感染后再用滅活免疫原免疫要高,單純PRRSV弱毒苗免疫一次的中和抗體水平要比單純PRRSV油乳劑免疫原免疫一次的要高。推測PRRSV感染后再用滅活免疫原免疫可能會增強病毒在豬體內的復制,抑制中和抗體的產(chǎn)生。因此感染過PRRSV的規(guī)�；i場,不建議使用滅活苗免疫。為了探究SHP1在PRRSV誘導的抗病毒免疫中的作用,本研究采用200個TCID50的PRRSV感染豬肺巨噬細胞(porcine alveolar macrophage,PAM),分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h后收集細胞及上清,分別設正常細胞對照組、聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,poly I:C)刺激對照組、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激對照組。采用ELISA方法檢測PRRSV感染的PAM培養(yǎng)上清中SHP1的蛋白表達情況。用實驗室已經(jīng)建立的實時熒光定量PCR方法對PRRSV感染組和各個對照組中PRRSV復制水平及各組PAM細胞中IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的m RNA轉錄水平變化進行定量分析,結果顯示:激活的SHP1對PRRSV感染后PAM中IRF7、NF-k B、IFN-β的轉錄有促進作用,對IRF3和TRAF6的轉錄有抑制作用。用LPS、Poly(I:C)刺激PAM細胞,在12h、24h、36h、48h均能促進IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的m RNA轉錄水平。LPS刺激PRRSV感染的PAM細胞促進了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的轉錄,Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM細胞也促進了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的轉錄。結果表明激活的SHP1會通過TLR介導的信號通路或未知通路來調節(jié)PRRSV誘導的抗病毒免疫反應水平。LPS、Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM細胞會抑制病毒的增殖,增強抗病毒細胞因子的轉錄水平。
【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【相似文獻】

相關期刊論文 前3條

1 Molina;王廣秀;;攝食PRRSV感染的豬肉對PRRS病毒傳播風險的評估[J];中國畜牧獸醫(yī);2009年08期

2 李凱年;用眼觀和鏡檢豬胎兒病變診斷PRRSV感染[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2000年04期

3 ;[J];;年期

相關會議論文 前1條

1 蒲靜;楊漢春;司興奎;周雙海;郭鑫;;PRRSV感染對豬肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子表達的影響[A];第一屆中國養(yǎng)豬生產(chǎn)和疾病控制技術大會——2005中國畜牧獸醫(yī)學會學術年會論文集[C];2005年

相關博士學位論文 前1條

1 江一波;與PRRSV結合的受體SN氨基酸及其在PRRSV感染偏嗜性中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2013年

相關碩士學位論文 前4條

1 王冬梅;不同免疫原對PRRSV誘導中和抗體的影響及SHP1在PRRSV感染中的作用[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 姜芳;PRRSV感染對Marc-145細胞IKKγ基因表達水平影響研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 劉蘇燕;PRRSV感染誘導內質網(wǎng)應激反應的分子機制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2010年

4 張振東;屠宰生豬肺臟病變評估及PRRSV感染狀況的調查分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2015年

，

本文編號：2579846