【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis)是一種因感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)而引發(fā)的人畜共患傳染性疾病,其致死率僅次于艾滋病。肺泡巨噬細(xì)胞是MTB在體內(nèi)潛伏的主要場所,同時也是抑制MTB在體內(nèi)傳播的屏障。MTB在體內(nèi)是潛伏還是傳播取決于MTB與宿主特別是巨噬細(xì)胞之間的相互作用,在這一作用過程中許多MTB蛋白發(fā)揮重要作用。所有BCG疫苗株比致病性結(jié)核分枝桿菌缺失RD1-RD16共16個差異區(qū)域(region of difference,RDs),研究表明這或許是分枝桿菌毒力衰減的主要因素,因此研究RD1區(qū)蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的免疫過程,了解其致病機制,一直是近年來人們研究的熱點。本研究首先克隆RD-1區(qū)所有基因,插入pMD-18T載體后測序驗證。然后用帶酶切位點的引物克隆Rv3872、Rv3873、CFP-10(10 kDa culture filtrate antigen,培養(yǎng)濾液蛋白10)、ESAT-6(Early secretory antigentic target-6,早期分泌6KD蛋白)以及Rv3878基因,將其插入具有綠色熒光蛋白標(biāo)記真核表達載體pEGFP-C1和帶有His-Tag組氨酸標(biāo)簽的原核表達載體pET-32a,構(gòu)建重組真核與原核表達載體。然后研究選取RD-1區(qū)重要毒力因子CFP-10、ESAT-6及CFP-10-ESAT-6的重組真核表達載體,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后不同時間細(xì)胞的凋亡率,同時分別在轉(zhuǎn)染24h、36h、48h后提取細(xì)胞總RNA,熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后不同時間后相關(guān)凋亡基因及IL-6、IL-10、IL-12的表達水平。觀察CFP-10與ESAT-6單獨在胞內(nèi)表達與共表達形成復(fù)合物后在胞內(nèi)表達所起的作用有何區(qū)別,探討其在胞內(nèi)表達對宿主細(xì)胞的影響為后續(xù)研究RD1區(qū)蛋白與宿主相互作用提供條件。研究結(jié)果顯示RD-1區(qū)基因成功克隆,成功構(gòu)建Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6以及CFP-10-ESAT-6、Rv3878重組真核表達載體以及Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6重組原核表達載體,通過倒置熒光顯微鏡觀察CFP-10、ESAT-6以及CFP-10-ESAT-6重組載體成功轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)表達,轉(zhuǎn)染24h、36h、48h后,與空載體對照組相比,CFP-10與ESAT-6重組載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著增加,與CFP-10及ESAT-6重組載體轉(zhuǎn)染組相比,CFP-10-ESAT-6重組載體轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞凋亡率下降但差異不顯著,在轉(zhuǎn)染36與48h后顯著下降。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明CFP-10與ESAT-6重組載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)一些相關(guān)凋亡基因Capase3、Capase7、Capase8、Caspase9、AIF、Bcl-2/Bax、IL-6、IL-10、IL-12等表達水平發(fā)生顯著變化,CFP-10-ESAT-6重組載體轉(zhuǎn)染組與CFP-10與ESAT-6組結(jié)果相反。CFP-10、ESAT-6主要通過調(diào)控Caspase酶活性及Bcl-2家族蛋白的表達影響細(xì)胞線粒體凋亡途徑,但CFP-10/ESAT-6共表達與CFP-10、ESAT-6單獨作用對巨噬細(xì)胞的凋亡的影響存在顯著差異。
【圖文】：

分析分枝桿菌 RD-1 區(qū)基因的 PCR 擴增擴增得到Rv3871、Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6、Rv38因，其片段長度分別為2065bp、300bp、303bp、288bp、110287bp左右，擴增條帶均位置準(zhǔn)確，明亮清晰且單一，與預(yù)圖4.7。將重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和HindⅢ進行質(zhì)粒PCR及雙相一致，且條帶單一無雜帶，具體結(jié)果如圖4.8至圖4.19。上海生工進行測序。對測序鑒定所得核苷酸序列與Genba1、Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6序列同源性均為17%，第76、212、465、656、770、1296、1378堿基G、C、C、C、T、A、T,7個堿基發(fā)生突變，且編碼的氨基酸序均為99.83%，1182與1184位堿基C、G突變?yōu)锳、T,但是其不變，不影響后續(xù)實驗。Rv3879c序列同源性均為99.69%7、1854、1927堿基C、T、T、C、A、C、A突變?yōu)門、C、突變，且編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，可能是擴增產(chǎn)物序。

分析分枝桿菌 RD-1 區(qū)基因的 PCR 擴增擴增得到Rv3871、Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6、Rv38因，其片段長度分別為2065bp、300bp、303bp、288bp、110287bp左右，擴增條帶均位置準(zhǔn)確，明亮清晰且單一，，與預(yù)圖4.7。將重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和HindⅢ進行質(zhì)粒PCR及雙相一致，且條帶單一無雜帶，具體結(jié)果如圖4.8至圖4.19。上海生工進行測序。對測序鑒定所得核苷酸序列與Genba1、Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6序列同源性均為17%，第76、212、465、656、770、1296、1378堿基G、C、C、C、T、A、T,7個堿基發(fā)生突變，且編碼的氨基酸序均為99.83%，1182與1184位堿基C、G突變?yōu)锳、T,但是其不變，不影響后續(xù)實驗。Rv3879c序列同源性均為99.69%7、1854、1927堿基C、T、T、C、A、C、A突變?yōu)門、C、突變，且編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，可能是擴增產(chǎn)物序。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.618

【參考文獻】

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本文編號：2575031