【摘要】：豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)與牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)同為黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的重要成員。CSFV的持續(xù)性感染是豬瘟難以根除的原因之一,對CSFV致病機理的闡明是制定有效防控措施的前提和基礎。病毒在宿主細胞內(nèi)的復制增殖,除了自身編碼一些必需蛋白外,還需要宿主細胞多種成分的協(xié)助。分子伴侶(Molecular chaperone)是協(xié)助細胞在正常和脅迫條件下保持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要蛋白組分,并參與許多細胞生理反應過程。J-結(jié)構蛋白(J-domain protein interacting with viral protein,Jiv)是屬于熱休克蛋白40家族(Heat-shock proteins 40,HSPs 40)的分子伴侶,在BVDV的感染和致病中發(fā)揮著重要作用。CSFV與BVDV的相關研究資料可相互借鑒。BVDV在自然界中有兩種不同的表現(xiàn)型,其中有宿主Jiv基因嵌合的毒株具有致細胞病變(CPE)的特性。這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在CSFV的研究當中。BVDV的研究發(fā)現(xiàn)Jiv蛋白主要通過促進NS2-3蛋白的切割進而促進病毒的復制。本研究驗證了Jiv蛋白核心區(qū)對CSFV復制的影響及其與病毒蛋白的相互作用,為篩選Jiv重組病毒的嵌合片段奠定基礎。此外,克隆獲得了CSFV C株全基因組c DNA,構建了C株的感染性克隆并進行了病毒的初步拯救。研究獲得以下結(jié)果:1.通過構建Jiv蛋白核心區(qū)段的過表達和干擾質(zhì)粒對細胞內(nèi)Jiv進行過表達和干擾,驗證了Jiv蛋白在CSFV復制中的促進作用。通過Co-IP的方法驗證了Jiv蛋白與CSFV蛋白的相互作用。2.根據(jù)CSFV AF531433毒株的全基因組序列設計引物,利用RT-PCR及重疊延伸PCR的方法擴增獲得覆蓋全基因組的8個片段。在基因組的5′端分別引入T7啟動子序列及CMV啟動子、核酶序列,在其3′端分別引入線性化酶切位點、T7終止子序列及SV40 Poly A終止序列。獲得兩種包含該病毒全長c DNA克隆的感染性克隆p BR322-T7-CSFV及p BR322-CMV-CSFV。3.利用T7啟動子,通過體外轉(zhuǎn)錄合成病毒RNA,檢測其濃度后通過電擊轉(zhuǎn)染到ST細胞當中。利用CMV啟動子將感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細胞進行病毒粒子拯救。對細胞連續(xù)傳代后通過RT-PCR對病毒粒子核酸進行檢測。
【圖文】：

了病毒粒子的拯救(Meyers et al. 1996)。Ruggli 等人用 CSFV CAP 株替換 Alfort 對應段后構建出嵌合的 Alfort 感染性克隆并拯救出了嵌合病毒(Ruggli et al. 1996)。Van Gennip 等人于 1999 年對病毒拯救的方法進行了改進(van Gennip et al. 1999)他們建立起一株穩(wěn)定表達 T7 RNA 聚合酶的 SK6 細胞系，省去了體外轉(zhuǎn)錄的操作直對構建好的 cDNA 克隆進行病毒的拯救。這一改進不僅簡化了實驗操作步驟，而且大提高了效率。利用長片段擴增技術，，Rasmussen 等人于 2010年以病毒總 RNA為模通過一次性擴增獲得了 CSFV Paderborn 株、C 株以及 BVDV CP7 毒株的全基因組列，并成功進行了病毒的拯救，大大簡化了感染性克隆的操作步驟(Rasmussen et 2010)。Li 等人在 2012 年利用真核細胞內(nèi)的 II 型 RNA 聚合酶系統(tǒng)再一次對感染性克的構建進行了改進，使得操作更加簡便、有效且構建的反向遺傳系統(tǒng)更加穩(wěn)定(Li et 2013)。該系統(tǒng)構建的感染性克隆在 CSFV 基因組的 5′添加了 CMV 啟動子、內(nèi)含子列、T7 啟動子以及榔狀核酶序列，保證了轉(zhuǎn)錄的啟動效率以及重組質(zhì)粒在菌體中傳時的穩(wěn)定性。在 3′端加入了 HDV 核酶序列、T7 終止子序列以及 SV40PolyA 序列有效保證了 3′端轉(zhuǎn)錄的終止（如圖 2-2）。

3.3.3 過表達及干擾掉 Jiv 分子后對 CSFV 增殖的影響將正常 PK15細胞與過表達 Jiv分子及慢病毒 pCDH-U6- Jiv -sh2干擾 Jiv 的細時用 CSFV 進行感染。48 h 后收取細胞核酸樣對病毒進行檢測，結(jié)果表明 CSFV殖分別被促進和抑制（圖 3-3）。說明 Jiv 分子在豬瘟病毒的復制過程中發(fā)揮了重用。圖 3-2 Real-time PCR及 Western blot檢測各質(zhì)粒的的干擾效果Fig. 3-2 The result of knock down of Jiv detected by Real-time PCR and Western blot
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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1 翁善鋼;;豬瘟的流行史和現(xiàn)狀[J];中國豬業(yè);2011年03期

本文編號：2567538